核酸适配子在生物医学领域中的应用

3通讯作者

文章编号:1007-4287(2010)06-0965-04

核酸适配子在生物医学领域中的应用

侯 1,魏　磊2,吴　军3,侯　巍3,孙　非13

(1.吉林大学再生医学科学研究所,吉林长春130021;2.空军航空大学门诊部,吉林长春130022;

3.解放军208医院461临床部,吉林长春130021)

1990年Tuerk [1]和E llingto [2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(sys 2

tematic ev olution of ligands by exponential enrichment ,SE LEX ),筛

选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer )。由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注。本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述。

1　SE LEX 技术原理与特点1.1　SE LEX 技术的原理[1]

SE LEX 技术筛选核酸适配子的过程主要有以下几个步

骤:①预先设计并合成寡核苷酸文库(DNA 文库或RNA 文库)。文库中的寡核苷酸的两端是固定序列(可依此设计

PCR 扩增的引物),中间随机排列约25-30个寡核苷酸,所以

文库的总量可达l014-15;②文库的筛选。将靶分子与文库进行混合孵育,使其能与靶物质特异性结合,形成靶物质2寡核苷酸复合物,后可采取滤膜法、磁珠法、毛细管电泳法或柱层析等不同的分离方法,将与靶分子结合的寡核苷酸从文库中分离出来。靶分子的混合物,通过PCR 扩增后,再进行重复筛选。一般筛选8-20轮左右,最后将筛选到的核酸适配子文库进行克隆、测序并鉴定所筛选的核酸适配子与靶分子结合的特异性和亲和力。也可通过后续实验验证所得适配子与靶分子结合的最短序列。

1.2　核酸适配子的特点

1.2.1　应用范围广　寡核苷酸随机库的每个核苷酸种类都

存在4种可能性(A 、C 、G 或T ),若随机区有n 个核苷酸,随机序列有4n 种可能性。30个左右的核苷酸文库的容量能达到

l014-15。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形

状的二级结构和三级结构,空间结构的多样性几乎可以与所有种类的分子发生作用。适配子可以通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物,有研究表明,适配子与靶分子的结合是相互诱导的适应性识别,当靶目标存在时,单链DNA 或RNA 发生适应性折叠与靶分子相互识别

[4]

。

目前,SE LEX 技术所筛选的靶分子广泛,可包括蛋白质、多糖、金属离子、核酸、酶、完整的细胞、病毒颗粒、病原菌等。因此,

与其他文库筛选技术相比,SEIEX

技术适应范围更加广泛。

图1　SE LEX 技术筛选核酸适配子的基本原理

1.2.2　高特异性和亲和力:核酸适配子只识别与其互补的

分子空间结构,能够分辨出靶分子结构上的细微差别。与靶分子的结合解离常数(kd )可达nm ol/L 甚至pm ol/L 水平,比抗体或其他类型配基有更高的亲和力和特异性,几乎可以完全避免非特异性结合[5]。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似,常规的茶碱单抗与后两者有交叉反应,而核酸适配子只特异结合茶碱,与其他两种物质无反应,且与茶碱的亲和力比与咖啡因高10000倍。

1.2.3　制备简单、产品稳定　核酸适配子与抗体相比,分子

量小(5-25ku ),制备简单、产生不依赖于动物、低成本、易重复、毒性低、免疫原性低、即使针对有毒物质也可筛选出其相应的适配子[6]。虽然适配子易被体内的核酸酶所降解,但各种核酸修饰方法可使适配子在体内的半寿期大大延长,稳定性增加;另外,适配子与聚乙二醇(PEG )等大分子物质结合可大大增加它的生物利用度。这些均为适配子作为治疗试剂打下了基础[7]。

适配子与单克隆抗体或者其他小分子药物的作用机理更为相似。核酸适配子的特性使它们在作为治疗药物和诊断试剂某些方面甚至超越抗体[8-9]。

2　核酸适配子在疾病治疗中的应用2.1　抗凝血作用

由于核酸适配子的作用方式是直接结合并抑制已经存

在的蛋白的活性,并且具有相对的安全性,价格适中等优点,正成为一种新型抗凝药物。

凝血酶是凝血系统的重要调节因子,它可使纤维蛋白原转变为纤维蛋白,产生凝血作用。核酸适配子ARC183是Ar2 chemix公司研制的已经进入临床实验的凝血酶抑制剂,可作为冠状动脉旁路移植过程中的抗凝药物[10]。它是一个长15nt的DNA分子,与凝血酶结合的解离常数(K d)为2nm ol/ L,与凝血酶原的K d为50nm ol/L。ARC183在体外有很强的抗凝作用,可以抑制纤维蛋白原在凝血酶作用下的激活以及凝血酶引起的血小板聚集,与肝素相比,它可以降低肝素诱导的血小板减少症的发生率,有效抑制凝血酶。在狗和猴的心肺分流术动物模型中,给予0.5mg/kg.min-1的剂量,其活化凝血时间(activated clotting time,ACT)为1500S。它在体内只有约100S的半寿期,可快速逆转其抗凝作用,未见明显的毒性作用和过度出血,显示了临床应用安全性。

适配子的短半寿期对抗凝血适配子是个有利的方面,而对于其它适配子的应用来说,如何防止被核酸酶降解是提高在体内作用稳定性的重要方面。已有多种修饰方法来修饰核酸适配子,其中较常见的是2′2氟和2′2氨基的修饰。例如:特异针对凝血因子IX a的适配子进行了2′2氟嘧啶修饰,同时在5‘端连接胆固醇分子,使得适配子在血循环中的时间从10min提高到1-1.5h。在单次注射剂量为0.5mg/kg时可使其抗凝血作用时间大于1h[11]。如何对适配子的这种长时间抗凝作用进行清除,Rusconi等[12]巧妙设计了此适配子的“解毒剂”。他们合成了17nt的针对适配子序列的反义寡核苷酸,它可通过杂交作用来抑制适配子的功能。在动物模型中注入10min后,此反义核酸就可中和适配子的95%的抗凝作用。

2.2　抗病毒

特异针对病毒外膜蛋白、整合酶、逆转录酶等的适配子均可用于抗病毒治疗。人类免疫缺陷病毒(HI V)包膜糖蛋白由一个外部糖蛋白(gp120)和跨膜域(gp41)组成,并在病毒进入到细胞中的重要作用。

Jiehua等[13-14]成功的筛选出具有双重功能的一系列抑制gp120核酸适配子,具有比抗体更好的阻止病毒复制的作用。

丙型肝炎病毒非结构区(HC V NS3)蛋白是治疗HC V的一个重要靶标。Fukuda K等[15]以HC V NS3h为靶分子,从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选得到与HC V NS3h 特异结合的寡核苷酸适配子,适配子在体外对HC V NS3h的活性具有一定的抑制作用。Fukuda等[16]提纯了针对NS3的RNA适配子,试验表明该适配子能够抑制NS3的90%的蛋白水解酶活性,而且在体内能够抑制麦芽糖结合蛋白2NS3 (M BP2NS3)70%的蛋白水解酶活性。最近,Jeon等[17]筛选出了能封闭流感病毒受体结合域而抑制流感病毒感染的DNA 适体。

2.3　抗增殖作用

血管生成在肿瘤侵袭、转移过程中发挥作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fac.tor,VEG F)是血管生成的重要调节因子,在大多数实体瘤和某些病理情况下升高。针对VEG F165的具有核酸酶抗性的RNA适配子可以有效阻止VEG F与人脐带血管内皮细胞结合和VEG F诱导的细胞增生。抗VEG F165的适配子可抑制人神经母细胞瘤细胞株神经生长因子的生长。湿性老年黄斑变性是老年人失明的主要原因。VEG F165RNA适配子可局部应用治疗湿性老年黄斑变性,临床试验效果较满意[18]。

转录因子E2F是调节细胞增殖的主要因子之一。Mann[19]将E2F适配子用于抑制静脉搭桥术后血管内皮增生的设想。通过还原压力介导转染法将E2f适配子转入将移植的静脉,结果12个月后,应用E2F适配子治疗组的移植血管的闭塞率,狭窄率明显较对照组低。

Farokhzad等[20]用携带多烯紫杉醇(docetaxe1)的海绵状纳米颗粒,其中含有辅聚物P LG A2b2PEG和对PS M A胞外部分特异的RNA适配子A10。体外实验中,此复合物可特异结合于前列腺癌LNCaP细胞表面表达的PS M A蛋白,显著增加其细胞毒性。单次瘤内注射,可使5/7的LNCaP细胞移植的裸鼠模型中的肿瘤全部消退,而且在109天内100%存活,对照组存活57%。此研究为将核酸适配子转移进入细胞以及疾病的靶向治疗提供了新的方法。

李真真[21]等建立SE LEX技术筛选胃癌细胞SG C27901适配子的方法,并初步鉴定获得的SG C27901细胞适配子。他们在体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库,通过优化PCR扩增条件,利用地高辛一抗地高辛抗体一碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SE LEX反复筛选获得胃癌SG C一7901细胞的特异性适配子。成功建立了SE LEX技术体外筛选胃癌细胞SG C27901高亲和性适配子的方法。

3　核酸适配子在诊断中的应用

核酸适配子与靶物质结合所呈现的高特异性和敏感性,使其在临床诊断中具有广泛的应用前景,应用适配子检测靶蛋白的研究不断增多,基于适配子的检测新技术也不断出现。

3.1　生物传感器

生物传感器是依赖于分子识别元件的作用来构建的。通常,生物传感器的识别元件主要是抗体、酶、受体和核酸等。目前已有大量的各类型生物传感器应用在实际工作中。但是这些传感器均具有一定的局限性,如单抗或多抗的制备比较繁琐、固定时活性易损失、活性保存时间有限、使用时对环境和样品条件要求比较高。然而,通过SE LEX技术筛选得到的寡核苷酸适配子具备类似抗体一样的对靶分子高的亲和力和特异性,但相比大分子的抗体,寡核苷酸适配子分子量小,结构简单,能保证合成的精确性及易连接其它分子进行修饰,如荧光素、生物素等。同时,寡核苷酸适配子可以变性、复性且速度快,可反复使用、长期保存。基于寡核苷酸适配子的这些优点,将适配子作为生物传感器的识别元件,制成适配子生物传感器(Aptasens ors),具有不可替代的优势。3.1.1　适配子电化学生物传感器:Ikebukuro等[22]研制出一