基因蛋白表达检测步骤

Western blot法测定蛋白表达

1 样品制备

称取100mg组织置于裂解液中充分匀浆，裂解液于4℃、12000rp m离心5min，取上清液。

2 定蛋白

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中蛋白含量，将每个样品的蛋白浓度调至相同。上清液与5×SDS上样缓冲液按5：1(v:v)混合后，沸水浴中加热5min，离心取上清。

3 蛋白质上样及电泳

每个样品取20μL上清液上样(蛋白总量约50μg)，于20%SDS-PAGE电泳分离。样品首先在80V恒定电压下电泳。当染料显示样品接近分离胶顶端时，调节恒定电压为110V继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

4 蛋白质转膜

电泳完毕后，卸下玻璃板并取出凝胶。遵循凝胶在负极，膜在正极的原则，按阴极–吸水纸–滤纸–凝胶–硝酸纤维素膜(NC)膜–滤纸–吸水纸–阳极的顺序将凝胶装配于转移装置上。200mA恒定电流条件下，4℃转移1h以上。转移完毕后，剪角标记NC膜，用1×丽春红染液染色以观察转膜效果。用TBS/T洗膜3次，每次5min。

5 封闭

用5％脱脂奶粉溶液封闭膜上的非特异位点，于4℃孵育过夜。

1.2.3.6 一抗孵育

加入一级抗体（工作浓度1：1000），4℃孵育过夜，使抗原抗体结合。一抗孵育结束后，用TBS/T洗膜3次，每次5min。

7 二抗孵育

加入HRP标记的二级抗体（工作浓度1：5000），室温孵育1h，以结合一级抗体。孵育结束后用TBS/T洗膜3次，每次5min。

8 ECL化学发光检测

按ECL试剂盒说明书方法曝光底片，显影、定影后保存胶片。

9 图像扫描及分析

将显影后所得条带扫描并保存为电脑文件，用Image J 图像分析软件对条带的灰度值进行分析。关键控制基因蛋白表达量以目的条带的灰度值与内参条带的比值代表目的蛋白的相对表达水平。