酶的定向进化

定向进化的原理
定向进化＝随机突变＋选择
随机突变的策略
易错PCR技术(error-prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了 一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一 种简化的DNA shuffling 技术
外显子改组
外显子改组(exon shuffling类似于DNA改 组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内 含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限 制，发生在整个基因片段上。
注：改造幅度小但更实际
外显子改组（exon shuffling）〔16，17〕 类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的 片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重 组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质 的有效途径之一. 与DNA改组不同,外显子改 组是靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而 DNA改组不受任何限制, 发生在整个基因片段 上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽 库.
体外随机引发重组
体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链 DNA为模板，配合一套随机序 列引物，先产生大量互补于 模板不同位点的短DNA片段， 由于碱基的错配和错误引发， 这些短DNA片段中也会有少量 的点突变，在随后的PCR反应 中，它们互为引物进行合成， 伴随组合，再组装成完整的 基因长度。 如果需要, 可反 复进行上述过程,直到获得满 意的进化酶性质

注：易错 PCR突变率需仔细调控，不能高低，靶基因取代碱基1.5~5个，经常一次突变很难获 得满意的结果。将一次易错 PCR获得的小突变累计产生重要的有益突变。
Chen等人〔5，6〕用此策略使在非水相（二甲基甲 酰铵, DMF）溶液中定向进化枯草杆菌蛋白酶E的 活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的 DMF中, 催化效率kcat/Km分别是野生酶的256和131 倍, 比活性提高了157倍. 将PC3再进行两个循环的定 向进化〔2〕, 产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高 3倍(在60%DMF中), 比野生酶高471倍. 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部, 故属于无性进化（asexual evolution）. 它较为费力、 耗时，一般适用于较小的基因片段（<800 bp）. 此 外, 使用该方法易出现同型碱基转换.
交错延伸
交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把 常规的退火和延伸合 并为一步, 缩短其反 应时间，从而只能合 成出非常短的新生链， 经变性的新生链再作 为引物与体系内同时 存在的不同模板退火 而继续延伸。此过程 反复进行，直到产生 完整的基因长度。
定向进化的筛选策略
突变体分离
琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生 长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基 因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的 克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单 个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排 成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。
易错PCR
易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目 的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随 机突变。
PCR:变性95、退火55、延伸酶的作用温度72
易错 PCR
是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩 增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓 度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs 浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变 扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率 向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分 子的随机突变体。
酶检测
通过酶促反应的特征 加入底物显色 荧光共振能量转移 同位素标记底物 通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测
信号探测
分光光度计和荧光酶标仪 气相色谱和高效液相色谱 质谱和核磁
通常, 筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关〔34，35〕. Venekei等人〔36〕报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变 体的方法和最佳筛选条件, 主要是利用蛋白酶选择平板初选, 再 配合活性染色（activity staining）和X-光片消化分析（Xray film digestion assay）加以验证, 并检测其活力, 快速筛 选了44 000个突变株. Roberts等人〔37〕用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性 酯酶结合力更强的抑制剂. 从含有4 900个突变体的基因库中， 获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3.6×10 6倍的突变体, 比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍〔38〕. 另有一些其他的筛选方法〔39，40〕, 如加入能产生可见 光信号的底物〔17〕或利用绿色荧光蛋白的荧光性质 〔41〕 等. 总之, 选择在酶的体外定向进化中至关重要,直接关系到其 成败.
在待进化酶基因的PCR扩增反应中， 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′ 校对功能的性质, 配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突 变， 构建突变库。
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连续易错PCR
连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突 变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反 复地进行随机诱变。
酶分子研究
认识与改造 改造： 合理设计（化学修饰、定点突变） 非合理设计（定向进化、杂合进化）
定向进化技术
人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突变， 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的 或者人为获得的）出发，经过基因的突变 和重组，构建一个人工突变酶库，通过一 定的筛选或选择方法最终获得预先期望的 具有某些特性的进化酶。
注：切割成随机片段，再进行不加引物的PCR循环，片段之间互为引物或模版，直到 获得全长的基因。该策略将亲本基因群中优势突变尽可能结合在一起。
DNA改组
该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变 尽可能组合的机会, 导致更大的变异, 最终 获取最佳突变组合的酶. 在理论和实践上, 它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和 “连续易错PCR”. 通过DNA改组, 不仅可加 速积累有益突变〔9〕, 而且可使酶的2个或 更多的已优化性质合为一体〔10～15〕.
该法优于DNA改组法的特点在于： （1） RPR可以利用单链DNA为模板, 故可10～20倍 地降低亲本DNA量; （2） 在DNA改组中, 片段重新组装前必须彻底除去 DNase Ⅰ, 故RPR方法更简单; （3） 合成的随机引物具有同样长度, 无顺序倾向性. 在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制 或以相似的频率发生突变; （4） 随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制.
酶的定向进化技术
一、定向进化的潜力
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应 得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎 所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这 样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
其他无性进化
化学诱导剂
65度下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，内切酶切下突 变了的基因片段，再克隆表达 致突变菌株 注：遗传变化只发生在单一分子内部属于无性进化
DNA改组
DNA改组(DNA shuffling) 又称有性PCR (sexual PCR)， 原理如图所示。
理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于 开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外 定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称 实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属 于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了 解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条 件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体 外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向 进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别 是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能 研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐 显示其生命力
杂合酶
杂合酶（hybrid enzyme）〔18〕是把来自不同 酶分子中的结构单元（二级结构、三级结构、功能 域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所 需性质的优化酶杂合体. 有许多途径可以产生杂合 酶，如定位诱变、DNA改组、不同分子间交换功能 域，甚至整个分子融合. 杂合酶可用于改变酶学 或非酶学性质, 是了解酶的结构-功能关系、以及相 关酶的结构特征的有力工具，不仅如此，它还可以 扩大天然酶的潜在应用，甚至可以产生催化自然界 不存在的反应的新酶分子. 杂合酶方法的有效性和 实用性已得到了实验的证实〔19～25〕
交错延伸
StEP法重组发生在单一试管中, 不需分离亲 本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换 模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化 过程〔28〕. 该法简便且有效, 为酶的体外 定向进化提供了又一强有力的工具.
酶法体外随机-定位诱变
为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰 岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶 体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-sitedirected mutagenesis)〔29～32〕. 该方法的内涵与酶的 体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变 体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于， 通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配. 从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更 灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化 的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的 理论研究起到更大的推动作用.
现代生物工程的要求
天然酶需各种生物分子之间协调，工业酶主要 考虑活力与稳定性，能具备长期稳定性和活性 天然酶作用环境与应用环境的差异，能适用于 水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成 底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药 物的原材料
如何利用相对简单的方法以 达到对天然酶的改造或构建新 的非天然酶就显得非常有研究 意义和应用前景。
利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限
随着酶催化应用范围的不断扩大和研究 的逐步深入，研究者发现，酶催化的精确 性和有效性常常不能很好地满足酶学研究 和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定 性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有 商业价值的催化功能 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
二、酶的定向进化简介
易错pcr、DNA改组、高突变菌株
蛋白质定向进化概念的提出
1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概念， 并用于天然酶的改造或构建新的非 天然酶。
定向进化与自然进化比较
自然进化非常缓慢，环境的多样性和适应方 式的多样性决定了进化方向的多样性。 定向进化模仿自然进化的关键步骤：突变、 重组、筛选