赤霉素

创新课题实验报告
课题：啤酒原料麦芽中的赤霉素的研究指导老师：李永仙
组员：孟昭文李航王润东
一．赤霉素性质研究现状
1.1 赤霉素的理化性质
赤霉素GA3（Gibberellic acid）
化学名：2，4a，7-三羟基-1-甲基-8-亚甲基-赤霉-3-烯-1，10羧酸-14内酯，
分子式：C19H22O6，
分子量：346.38
又称赤霉酸。

其结构内含有3个环，一个内酯环，八个手性碳，羟基，三个双键和一个羧基。

是真菌恶苗病菌所产生的刺激植物生长抗生素。

结构式如下：
赤霉素GA3工业品为白色结晶粉末，含量在85%以上，熔点233-235℃。

由于赤霉素GA3官能团的特殊排列方式以及几个易变化部位的相互牵制，使得它在很温和的条件下就有发生重排列或异构化的可能。

但是，它的结构在常温避光条件下是稳定和易保藏的。

赤霉素GA3易溶于醇类（比如甲醇、乙醇）、丙酮、醋酸乙酯等、乙酸乙酯有机溶剂和pH6.2的磷酸缓冲液中。

微溶于水、醚中，不溶于石油醚、苯、氯仿等溶剂中。

在温度低的酸性条件下，比较稳定。

遇碱中和失去生理效用。

其溶液在pH3-4下最稳定。

在中性或微碱性条件下，稳定性下降。

高温能明显加速其分解，因此赤霉素GA3不能以水溶液形式在室温下长期保存。

1.2赤霉素GA3检测方法与残留限量
目前关于赤霉素研究最多的是机理与应用上，对赤霉素的安全性分析和检测方法国内外报道的不多。

主要方法有绵联免疫检测法，高效液相色谱法、薄层层析法、分光光度测定法。

美国、日本等国规定水果、蔬菜中赤霉素最高残留限量为0.2mg/kg，而我国还没有相关限量标准。

目前检测赤霉素含量方法有以下几种，而麦芽中赤霉素含量检测尚无先例：
黄少白（1）用碳二亚胺（EDC）法将赤霉素A（GA4）与卵清蛋白（OVA）连接，形成GA4-OVA 复合物用于包板，利用GA4-ME与GA4-OVA对兔抗GA4-PAbs竞争结合反应，建立了GA1,3,4,7,间接酶联免疫检测法（ELISA0。

其灵敏度、检测范围和最小检测样品量分别为45pg，0.2-200ng和50-500mg，样品的平均回收率为97%，批内和批间的变异系数分别为4.2%和4.8%。

吴硕如（2）GA4-BSA结合物诱导制得兔抗，采用放射免疫测定法检测赤霉素，与GA1，GA3,GA7有较高的交叉反应率，而与GA5、GA9与GA20的交叉反应率甚小，检测范围25-800pg/50ul 之间。

李进（3）采用竞争ELISA检测赤霉酸，在1ug/ml to150ug/ml范围内有较好的线性关系，回归方式为:y=0.44+15.59,相关系数为0.99，与HPLC比较有较好的一致性。

湛社霞（4）建立固相萃取-高效液相色谱法测定水果中赤霉素的含量。

水果样品经50%甲醇-水提取后，用HLB萃取，以甲醇+水（3+1）洗脱，洗脱液经C18柱分离、二极管阵列检测器检测，用高效液相色谱仪测定。

赤霉素回归方程为I=13358.46*C+1.69，相关系数r>0.9999，相对标准偏差<5%，加标回收率可达90%以上，以信噪比为3时，赤霉素的最低检测出限为0.11ug/ml。

陈小鹏（5）采用高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素，试材用液氮研磨以100%冷乙腈浸提，浸提液抽虑，氯仿去除色素，PVP去除酚类杂质，乙酸乙酯提取激素，最后过PT-C18柱上进行分离，紫外检测器在252nm波长下检测、鉴定，GA3的检测线为0.242ugFW，回收率为80.2%。

周艳明（6）建立水果中赤霉素残留量的高效液相色谱检测方法，样品采用80%的甲醇提取，经液液萃取净化，以紫外检测器检测。

添加回收率为82.8%-100.6%，变异系数为3.2%-4.6%，最低检出限为0.017mg/kg。

张有林（7）用SymmetryC18色谱柱（4.6mm*150mm）,以乙腈和 1.8%乙酸[V(CH3CN):V(1.8%CH3COOH)=1:1]为流动相，流速为0.5ml min-1,Waters 2487UV-检测器，在检测波长254NM，柱温25°C的条件下，同时分离并测定了银凤桃中的GA3，回收率分别达到100.1%，该方法测量灵敏度达0.047ng/ml，精密度RSD%<0.1。

黄红林（8）建立了固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）法分析番茄中赤霉素GA3残留量的方法。

线性范围为0.21-1.05*102mg/l，检出限为0.011mg/kg,加标回收率为88.45%-95.90%，其RSD为1.15%-6.56%。

王骏（9）建立用HPLC/MS测定猴桃中赤霉素的方法。

用甲醇-氨水溶液提取式样中的赤霉素，经固相萃取净化，以反相液相色谱分离、质谱检测器测定。

赤霉素的最低检测线均为4.0ug/kg,回收率92.5%-101.4%，相对标准偏差1.68%-3.79%。

葛雅琨（10）使用高效液相色谱（HPLC）对蔬菜中的农药GA3残留进行分析检测，用80%甲醇溶液作为提取剂，建立了液液萃取与SPE2PAKC18固相萃取相结合纯化GA3的方法。

检测波长为206.00nm，流动相为甲醇与7.5nM甲酸水的体积比为3：7的溶液，实验结果为GA3标准曲线的线性方程为：y=5.9242x+4.9434，相关系数R=0.9995，最低检测限为0.5ug/g,平均回收率都在80%以上。

侯圣洁(11)采用LC-MS/MS方法同时检测小麦中的赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸，检测限分别为0.005ug/ml，2.2ug/ml and 0.003ug/ml,回收率为95.5%-102.4%。

肖志壮（12）报道，赤霉素在体积分数为70%乙醇溶液中，与98%（质量分数）硫酸作用生成的产物在412nm波长处具有最大的吸收峰；在0-200mg/l浓度范围内，赤霉素浓度与其吸光度值呈线性关系，其相关系数大于0.990；检测限为2mg/l,可信度在99%以上。

二．立题背景及意义
啤酒生产以大麦麦芽为主要原料，麦芽的制备是啤酒生产的开始。

原料大麦需经过除杂-精选-分级-浸麦-发芽-焙燥-除根，最终得到成品麦芽。

当大麦籽含水量超过25%时，即开始生理萌发产生赤霉素，刺激糊粉层细胞分泌系列水解酶。

麦芽制造的目的就是在人工控制的条件下，使大麦在发芽过程中产生淀粉酶、蛋白酶、半纤维素等多种水解酶系，降解大麦籽粒中蛋白质、淀粉、半纤维素等高分子物质成中低分子物质，少部分低分子的降解产物被用于合成根芽，大部分降解产物被储存于胚乳中，以构成麦汁中的营养成分。

制卖过程中为了加强水解酶系的分泌速度和分泌量，强化水解酶系的活性，普遍会在浸麦是添加一定量
（2mg/kg大麦）的商品赤霉素，进入麦粒中的GA3少部分伴随除根而除去，其余部分的则保留在成品麦芽中，随着麦芽的糖化发酵最终进到啤酒里。

随着食品安全法的颁布及实施，对人体会造成伤害的物质必须控制在一定的限量内，中国酿酒协会啤酒分会于2009年规定将啤酒中的赤霉素GA3控制在0.2mg/升啤酒。

为此，通过研究大麦发芽及啤酒酿造过程中赤霉素在数量上的变化，为成品酒中的赤霉素的控制提供理论依据。

由此可见，本实验的研究是十分有意义且有前景的。

三．实验过程
3.1 赤霉素标准曲线的建立立及检测限确定
3.1.1HPLC检测条件的确定
色谱柱：Eclips,XDB-C18(5um,4.6*250mm)
柱温：40°C
流动相：甲醇：0.1%甲酸水（30：70）
流速：1.0m/min
检测波长：20um 325min
3.1.2 GA3标准曲线的建立
配制不同浓度的GA3标准溶液，根据在HPLC中的出峰面积建立相应的工作曲线。

准确称取100mg赤霉素，溶解于80%甲醇(分析纯），取1L容量瓶，定容。

取10mL容量瓶5个，编号4～8，取小离心管3个，编号1～3.
8号中加入以1L容量瓶中溶液定容
7号中加入8mL 1L容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
6号中加入6mL 1L容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
5号中加入4mL 1L容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
4号中加入2mL 1L容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
3号中加入1mL 8号容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
2号中加入1mL 7号容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
1号中加入1mL 6号容量瓶中溶液, 以80%甲醇定容
3.1.3 过柱，得到赤霉素标准曲线
3.1.4检测限确定
100mg/L赤霉素标准样（溶剂为分析纯甲醇），过HPLC液相之后所得峰面积足够大，即将标准曲线上限设置为100mg/L。

GA3最低检测限为2mg/L（下限）
3.2 麦芽样品中赤霉素含量检测
3.2.1第一次实验：
1.取麦芽50g，
2．以食品楼仪器超微粉碎，5min，得液体约50mL
3．将液体和麦渣以20%甲醇100mL溶解
4．以滤纸过滤，得液体A，分离固体麦渣
5．取4只50mL离心管，将麦渣均分四堆放入，每管各加约20mL甲醇，使之重量相等，离心机离心，2000r/min，3min。

6．取离心上清液，与液体A混合
7．以磷酸一氢钠调pH至8，
8．以石油醚萃取色素，除去下层石油醚
9．旋转蒸发至干，以2mL甲醇溶解
10．过柱
3.2.2第二次实验
1.取麦芽100g,
2.以食品楼仪器超微粉碎，5min，得液体约100mL
3.将液体和麦渣以乙酸乙酯100mL溶解
4.连续超滤3次，弃去麦渣，得到液体约200mL
5.以石油醚萃取除去色素，失败
四．实验结果及分析
4.1第一次结果及分析
过液相柱，出峰很慢且量很少。

分析原因可能有：
1．提取方法存在问题，手法不熟练，大部分赤霉素可能于液体转移过程中损失
2．选取萃取液可能不是最合适
3．最后旋转蒸发至干，以2mL甲醇溶解的溶解效率低
4．液相柱子流速设置小
4.2第二次结果及分析
从色素的提取效果来看，以乙酸乙酯萃取效果与甲醇相比差别不大。

而用连续超滤对麦渣中物质提取效果远远好于过滤及离心。

最后石油醚提出色素失败，分析原因可能是pH 在酸性条件下，石油醚无法从乙酸乙酯中萃取出色素。

4.3 总体分析
本实验对结果最重要的过程是麦芽样品的预处理，即从中提取赤霉素的方法。

其中最值得值得研究的是萃取剂选择。

五．实验展望
5.1 啤酒样品的预处理
5.1.1 啤酒样品减压浓缩
5.1.2 浓缩样品中GA3的萃取
5.1.3 测定加标回收率
5.2 对测定影响因素的研究
5.3 麦芽样品中的GA3的检测—检测不同麦芽中的GA3含量
5.4 检测方法的应用
5.4.1 检测大麦发芽过程中GA3含量的变化
5.4.2 检测发酵过程中GA3含量随发酵时间的变化
参考文献
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（2）吴硕如，周夔，赤霉素1，2，3，7放射免疫测定药盒的研制[J]，南京农业大学学报，1990，13（1）：24-27
（3）湛社霞，孙世宏，臧李纳等，SPE-HPLC法测定水果中的赤霉素、苯甲酸、糖精钠和胭脂红。

中国卫生检疫杂志，2009，19（3）：579-581
（4）陈小鹏，王秀峰，孙小镭等，高效液相色谱测定黄瓜瓜条中赤霉素和脱落酸含量[J].
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高效液相色谱法同时测定银凤桃中的赤霉素和脱落酸[J].
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固相萃取-高效液相色谱法测定番茄中的赤霉素GA3残留[J]。

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（8）王骏，张卉，胡梅，液相色谱-质谱测定猕猴桃中赤霉素和脱落酸的含量[J],食品工业，2008，4：74-76
（9）葛雅琨，张元新，胡睿，素材中赤霉素残留量的高效液相色谱检测方法研究[J].吉林化工学院学报，2005，22（2）：13-16。