免疫荧光原位杂交的原理应用

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。

1特点编辑原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。

荧光原位杂交技术FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点

1、荧光试剂和探针经济、安全；

2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；

3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；

4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；

5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；

6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

2简介编辑1969年，Gall和Pardue等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑制杂交法的创建，使FISH 技术得以迅速发展。随后，Cremer等用生物素和汞或氨基乙酰荧光素等非放射性物质标记探针，创立了双色FISH技术。1990年，Nederlof 等用3种荧光素成功探测出了3种以上的靶位DNA 序列，从而宣告了多色FISH 技术的问世。

FISH技术是一种非放射性分子遗传学实验技术，其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性—退火—复性—洗涤后即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

FISH技术有以下几点优势：①安全、快速、灵敏度高；②探针能较长时间保存；③多色标记，简单直观；④可用于中期染色体及间期细胞的分析；⑤可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。

3原理编辑基本原理

荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH 所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误差等。与之比FISH则具有①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年.②方法敏感,能迅速得到结果.③在同一标本上,可同时检测几种不同探针.④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究。

荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染

色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

技术要点

FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体也可以是间期细胞．间期细胞可以是冰冻切片，也可以是细胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorine(AAF)等均可用于探针标记。前两者较为常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或随机引物法(Random Primer)对探针标记。在已知探针DNA结构及序列情况下也可采用PCR或RNA逆转录法标探针。通常用于Biotin 标记的探针应大于1000bp以下的探针，不易标记成功。对PCR技术来标记。近年来，Vysis 公司成功的生产些大片段的DNA探针（100-400kb）。由于控针较长故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不仅使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。如探针是具有重复序列的DNA或粘粒、Y AC探针，在杂交液中加上用超声断碎的人体胎盘组织DNA或Cot DNA,以阴断探针和染色质之间非特异性的结合。

荧光信号在高压汞灯产生的短波激发光下常引起荧光信号淬灭的发生，可将DAPI或PI稀释于P-phenlenediomine的甘油缓冲液中。任何荧光显微镜均可用于观察FISH信号，但对单拷贝探针的信号需要质量较好的荧光显微镜。如采用双色或多色滤光片可以同时观察FITC、Texas-Red等多种颜色的FISH信号，不论是染色体还是单拷贝基因的FISH信号均可用高度敏感和高分辨率的彩色胶片摄取，也可通过CCD(charge coupled device)的照相系统或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光扫描共焦成像系统）将摄取的信号储存在计算机内，经软件处理后，将信事情显示在荧光屏上。由于有多种方法标记DNA探针，故一次杂交可以同时观察多个探针的信号，如两个不同的探针分别用Biotin和Digoxigenin标记，杂交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分别与探针上的Biotin 和Digoxigenin结合，应用双色滤光片，在显微镜下就可以同时看见带有绿色荧光的FITC和红色荧光的Texas-Red信号。同理，采用三种或三种以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等标记探针，然后用多种不同颜色的荧光素，如FITC（绿色），Rhodamine(红色)，AMA或Cascade Blue(兰色)等结合抗体进行检测，可同时得到多种不同颜色的荧光信号，如采用不同的排列组合，最多可同时检测7种不同的探针。由于常规的荧光显微镜的照像系统，彩色胶片不易多次曝光，限制了这种联合标探针的应用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系统，先分别多次摄取灰色的影像关储存在计算机内，而后冠以人为的颜色，运用软件系统事例各次得到的影像，最终形成一个复合的多颜色的图像。

此外，对已做过G显带的染色体片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH这样可更清晰的辩认各条染体及染色色体结构异常（包括某些复杂的易位，插入，倒位等）FISH和G显带技术结合不仅可以用新近G带处理过的片子，而且还可用陈旧的G带片子。因此，FISH 技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析。

FISH技术和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）结合，可以更精确地描述原必于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型或复制片段的性质。FISH和细胞免疫化这技术结合，可以同时用多种颜色反应检测不同的核苷酸链和蛋白质，这样可以在单个细胞内同时找到基因的位点，转录和翻译和产物，有助于对核甙酸结构与功能以及基因表达产物之间关系的研究。在基因图谱绘制中，FISH和Linkage mapping结合起来，即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地定下来。

4应用编辑该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。