第二十八章 致癌基因与癌症

第二十八章致癌基因与癌症
所有高等真核生物一个主要的特征是机体生命期的有限性，即便是生长和分裂规律性极强的单个体细胞也是如此。

然而，癌细胞却是一个特例，它们是失去正常生长控制的一类变种细胞。

癌细胞可以在不适宜的位点生长或无限繁殖。

这对于它们的宿主机体可能是致命的。

当细胞永生(Immortalization)时会发生三种类型的变化(图28.1):
•无限繁殖(Metastasis)，即具有无限生长的特性(此时在表型中不一定有其它变化)。

•转化(Transformation)指难以观察到生长的正常限制因素。

例如，转化细胞不再需要细胞生长所需的一些因子。

•转移(Matestasis)指癌细胞获得侵染正常组织的能力，这样癌细胞才能从原组织中转移并在体内的其它细胞或组织中生长。

为了研究使细胞不受正常控制产生肿瘤的异常特征，我们需要在体外比较正常细胞和转化细胞的生长特点。

转化细胞的体外培养比较容易，但它们对应的正常细胞的体外培养则非常困难。

当细胞被从脊椎动物的体内取出转移到培养基上培养时，它们会分裂几个循环，但此后会进入衰老(Senescent)阶段，细胞生长终止。

随后细胞进入危机期(Crisis)而死亡。

能生存下来的细胞具有了无限分裂的能力，但在这一过程中它们的特性已经发生了改变。

危机期的特点了解甚少，而且也不了解那些使细胞适应在培养基上生长的分子变化，但原则上，这些构成了无限繁殖的过程(转择的特性因种和组织的不同而异。

一般来说，鼠细胞在～12代度过危机期。

尽管人细胞很少能体外生长，而仅有某些特殊种类的人细胞能够生长，事实上人细胞在～40代进入危机期)。

由于危机期存在，大多细胞有有限的生命期，这可使我们从两方面研究未转化细胞，但均不完美：
•原始细胞是直接从机体中取出的细胞的下一代。

它们如实地模仿体外表型，但大多情况下只能存活很短一段时期，因为培养基在危机期被用尽。

•度过危机期的细胞形成非致癌细胞系(Nontumorigenic cell line)。

它们能无限繁殖，但经过危机期时其特性发生了改变，可能在适应培养基时会持续改变。

这些变化可能部分类似于肿瘤形成(Tumor formation)中发生的变化。

肿瘤形成减少了细胞的用处。

已建立的无限繁殖细胞系通常是非致癌的。

非致癌细胞系在同源培养基上显示出相似的细胞特征，包括:
•贴壁依赖性(Anchorage dependence)——细胞需要贴附在固体或坚硬表面。

•血清(或生长因子)依赖性(Serum dependence)——血清提供必需的生长因子。

•密度依赖性抑制(Density-dependent inhibition)——细胞仅生长到一定密度，可能由于细胞间的接触使细胞生长受到抑制。

•细胞骨架组构(Sytoskeletal organization)——细胞是扁平的，在生长附着物表面延生，并形成紧纤维(肌动蛋白质丝组成)组成的典型延长的网络结构。

由于这些特征的结果是细胞呈单细胞层(Monolayer)生长。

通过参考以上特征我们可以判断正常状态的细胞。

当然，任何已确立的细胞系提供的是体外控制的类似情形。

由于这些细胞能发生染色体数目的变化而非双倍体，我们必须十分谨慎的分析它们生长控制的遺传因素。

染色体组发生变化的这些细胞称为非整倍体(Aneuploid)。

从肿瘤中培养出来的细胞发生了以上特征的部分或全部变化，称为转化(Transformed)细胞。

转化后的细胞生长很少受到限制，减少了血清依赖性，不需要附着在固体表面(使细胞呈聚集生长而非单层)和成堆状生长。

此外，这些细胞在注入到一些适宜试验动物体内后能形成肿瘤。

图28.2表示正常成纤维细胞(Fibroblast)与转化细胞在培养基上生长的对比状况。

图28.1 三种辨别癌细胞和正常细胞的方法：在
培养细胞中的顺序变化与肿瘤特性相关。

图28.2 正常的成纤维细胞培养时沿壁形成一薄层，而转化的成纤维细胞相互堆叠挤压长成细
胞团。

图中左边为含正常细胞的培养物，右边
为转化细胞培养物。

上图是用光学显微镜显示
的效果，下图为用扫描电镜显示的效果。

认为癌细胞的形成具有单一的基础是不太可能的。

相反，许多细胞的组成变化赋予了细胞转化为肿瘤的能力。

然而，培养基中细胞无限繁殖和转化特性的联合变化为动物肿瘤的形成提供了标准。

通过比较转化细胞和正常细胞，我们希望认识肿瘤形成的遗传基础并了解转化过程中发生的表型过程。

一些事件使正常细胞转化为转化细胞，为肿瘤形成中的一些过程提供了模型。

通常，多样的遗传变化是产生癌变的必要因素；并且有时肿瘤在经过一系列渐进变化后其病毒性大大增强。

随年龄增长发生的人类癌症证实，在20～40年期间发生大概6～7个事件才能诱发产生癌症。

极少情况下，肿瘤形成会按孟德尔定律遗传。

这表明单一的遗传变化是重要和不可缺的组成成分(尽管许多其它变化也是必需的)。

许多基因影响这细胞变为转化形式的频率，这些因素称为致癌因素(Carcinogens)。

有时这些致癌因素被分为“起始”和“启动”肿瘤形成，表明在癌发生过程中存在不同阶段。

致癌因素可能导致后天变化或经常性的起作用，直接或间接的改变细胞的基因型(Genotype)。

有两类基因突变可引发转化：
•致癌基因(Oncogenes)最初是定义为病毒携带的、能够引起靶细胞的转化基因。

大部分病毒性癌基因具有细胞副本，参与正常细胞功能，这些细胞基因称为原癌基因(Proto-Oncogenes)，并在特定情况下它们在细胞中的变异或异常活性与肿瘤形成息息相关。

目前已有100种癌基因被鉴定。

这些致癌基因分为几个类群，分别代表从跨膜蛋白质到转录因子的不同活性类型，其功能的确定可能会解释肿瘤形成种许多类型的变化。

一个癌基因的产生代表一种功能的获得，其中细胞原癌基因被异常激活。

这可能是蛋白质或组成活性发生了变异、过量表达或适当时候停止表达。

•抑癌基因(Tumor suppressors)是在肿瘤形成缺失突变体(或其它失活变异)中鉴定的。

证明其特性的最有力证据是通过对特定遗传癌症的研究获得的。

癌症患者体内产生肿瘤，它们丢失了某种遗传因子，因而缺乏某种活性基因。

有证据表明，这些抑癌基因的突变可能伴随癌症的大范围进攻。

目前已知大约10种抑癌基因。

它们代表在细胞周期或细胞生长中加强限制作用而使肿瘤基因丧失功能的基因类群。

前面我们讨论了这两类基因如何鉴定、致癌基因如何激活和抑癌基因如何失活。

现在我们将考虑这些事件的分子基础和癌基因如何从细胞表面信号传导扩展到细胞核中激活转录因子的途径相联系。

28.1 转化病毒携带致癌基因
转化可自然发生，可由一些化学因素诱导产生，更多的是由于肿瘤病毒(Tumor virus)的感染引起。

现在已知有许多类型的肿瘤病毒，包括DNA 和RNA病毒，并且它们广泛的发生在鸟和动物王国。

一种肿瘤病毒的转化活性来自特定的基因或病毒基因组中的基因。

致癌基因由于它们的致癌性或致癌性而被命名。

一个致癌基因能起始一系列有细胞蛋白质执行的事件。

最终，病毒通过有规律的开关来改变靶细胞的生长特性。

图28.3概括了主要转化病毒类型的一般性质。

DNA病毒携带的致癌基因指定了用于失活肿瘤抑制的蛋白质，所以它们的行为部分模仿了肿瘤抑制因子功能的丧失。

逆转录病毒携带的致癌基因源于细胞的基因，因此它们可能模仿动物原癌基因中功能获得突变的行为。

多瘤病毒(多瘤病毒)和腺癌病毒(Adenovirus)已从许多类哺乳动物中分离出来。

尽管一种病毒在野生中仅在某单一宿主体内生存，但它们可能在许多其它种的细胞中生长。

细胞对感染的反应取决于细胞种类和表型，可分为两类。

如图28.4所示:
•许可(Permissive)细胞高效地被感染。

病毒继续完成早期和晚期阶段的裂解周期。

周期以子病毒的释放结束并且导致(最终)细胞死亡。

•非许可(Nonpeimissive)细胞不能高效地被感染，并且病毒的表现受阻。

一些感染的细胞被转化。

在这种情况下，单个细胞表型变化并且培养物以一种无限制的方式永久存在。

普遍的机制来自DNA肿瘤病毒的转化。

致癌基因的潜力存在于单个功能或病毒的裂解周期早期活跃的相关功能中。

当转化发生时，相关的基因整合到转化的细胞基因组并组成型(Constitutive)表达。

这揭示这些病毒转化的一般模型(图28.5)，致癌基因的组成型表达产生转化蛋白质(致癌蛋白质)。

图28.3 用于转化的病毒中可能含有癌基因。

图28.4 一个进入裂解循环的DNA肿瘤病毒感染
细胞后，受感染的许可细胞会持续增殖，而受转
化的非许可细胞则发生表型的改变。

图28.5 被多瘤病毒和腺病毒转化的细胞，其基
因组整合有病毒早期区域的序列。

整合位点是
随机的。

多瘤病毒很小，在鼠类中很普遍，类似的病毒猿病毒40(Simianvirus 40，SV40)从恒河猴(Rhesus monkey)细胞中分离的，并且最近对人类病毒BK和JC比较深入的研究。

当注射到初生啮齿类动物时，所有多瘤病毒都能引起肿瘤。

在生产性感染期间，每个病毒的早期区域采用选择性剪接方式合成重叠性蛋白质——T抗原(名字原反映它们分离自肿瘤细胞)。

各种各样的T抗原在裂解周期有许多功能。

它们是晚期区域的表达和病毒DNA复制所必需的。

多瘤病毒转化的细胞包含部分或所有病毒染色体整合拷贝，整合的序列总是包括早期区域。

T 抗原有转化活性，它们能与细胞的蛋白质相互作用。

具有独立地直接与病毒染色体相互的能力。

SV40要求大T和“小t”抗原，并且多瘤要求“T”和“中T”为转化的抗原。

乳头瘤病毒(Papillomaviruses，HPVs)是引起上皮(Epithelial)肿瘤的小DNA 病毒。

有约75种人乳头瘤病毒，大多数与良性的生长有关(例如疣)，但有些与癌症有关，特别是宫颈(Cervical)癌。

宫颈癌表达产生两种病毒相关的产品：E6和E7 蛋白质，它能使靶细胞永生。

腺病毒(Adenoviruses)最初从人的腺样增殖组织中分离，类似的病毒也已从另外的哺乳动物中获得。

它们组成一个相互关联的病毒的家族，有80多个成员。

人类腺病毒研究的最详细，并且与呼吸道疾病有关。

它们能感染一个范围内不同种的细胞。

人细胞是许可细胞并且能高效地被腺病毒感染，病毒在感染细胞内复制。

但是一些啮齿类动物的细胞是非许可细胞。

所有的腺病毒都能转化培养的非许可细胞，但不同病毒的致癌力不同，烈性病毒是当它们被注射进初生啮齿类动物时就能引起肿瘤。

腺病毒转化细胞基因组，使之获得包含E1A 和E1B 基因的早期病毒区域的一部分，它们编码若干核蛋白质。

人疱疹病毒(Epstein-Barr virus，EBV)与人类许多疾病有关，包括传染性单核血球增多症(Mononucleosis)、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)、非洲Burkitt 淋巴瘤(Lymphoma)和其它淋巴增生紊乱。

EBV的宿主范围有种和细胞表型的局限性。

在转化细胞中发现了病毒DNA，尽管在有关它是否是完整的方面存在争议。

但具体是哪些病毒基因是转化所必须的仍然不清楚。

逆转录病毒代表一种与DNA 肿瘤病毒不同的情况。

它们能水平和垂直地传递遗传信息，如图28.6所示。

病毒感染的正常进程完成水平转移，在这过程中同一宿主体内被感染的细胞数目增多。

当病毒感染机体病毒生殖细胞并整合进基因组形成一个内源原病毒，就开始了垂直转移，像溶源噬菌体一样，它按孟德尔定律遗传给子代(见第11章)。

逆转录病毒的生命周期通过RNA和DNA 模板来扩增遗传信息。

逆转录病毒感染过程要经过如图16.2所示的阶段，RNA逆转录产生单链DNA，而后DNA复制产生双链DNA，并且最后整合进染色体，并可再转录成感染RNA。

整合进染色体导致原病毒的垂直传播，原病毒的表达可以产生水平传播的逆转录病颗粒。

整合是每个逆转录病毒生命周期中正常的部分，不管它是非转化或转化的。

按肿瘤发生的起源将肿瘤逆转录病毒分为两组:
•无缺陷病毒(Nondefective virus)遵循一般逆转录病毒生命周期。

它们提供有长的潜伏期的感染介质，并且经常与白血病(Leukemias)的诱导有关。

两个经典的模型是猫白血病病毒(Feline leukemias virus，FeLV)和鼠乳房肿瘤病毒(Mouse mammary tumor virus，MMTV)。

肿瘤发生不依赖单个病毒的致癌基因，但是依赖于病毒激活一个细胞原癌基因的能力。

•急性(Acute)转化病毒以致癌基因形式获得了新的遗传信息。

这基因不存在祖先(非转化病毒)中，它源于病毒在易传染周期内通过转导(Transduction)捕获的细胞基因。

这些病毒通常能很快在体外诱导肿瘤形成，并且它们能在体外转化培养细胞。

反映出每个急性转化病毒有特定靶细胞的独特性，这些病毒根据在动物体内诱导肿瘤的类型:白血病、肉瘤
(Sarcoma)、癌等等划分成几类。

当逆转录病毒与细胞序列交换部分自己的序列以获得细胞基因时(见第16章)，它产生
图28.7所示结构。

这是罕见的，但是创造的转导病毒有2个重要性质
:
图28.6 当逆转录病毒感染新宿主时，它的遗传信息是水平传递的，而当病毒基因组整合到宿主生殖细胞中遗传给后代时，信息是垂直传递的。

图28.7 一个转化逆录病毒在其自身基因的位置携带有宿主细胞的DNA序列。

•通常不能由自我复制，因为与细胞序列交换使之失去了复制所需的病毒基因，所以几乎所有病毒都是复制缺陷型(Replication-defective)。

但借助野生型病毒感染的刺激它们能够复制。

野生型辅助(Helper)病毒能恢复其重组中失去的功能(RSV是例外的转导病毒，它保留复制的能力)。

•在感染期间，转导病毒携带在重组中获得的细胞基因，它们的表达可能会改变感染细胞的表型。

携带细胞遗传信息刺激靶细胞生长，更利于转导病毒完成期感染周期。

如果一个病毒获得产生刺激细胞生长物质的基因，这将使病毒能够通过刺激所感染的特殊细胞的生长而传播(这也是重要的，因为逆转录病毒仅在增殖细胞中复制，见第11章)。

在病毒捕获了细胞的基因以后，基因可能发生变异而加强其影响细胞表型的能力。

当然，转化不是逆转录病毒影响其宿主的唯一机制。

著名的例子是HIV-1 逆转录病毒，它属慢病毒(Lentiviruses)的逆转录病毒组，病毒感染并且杀死带CD4 受体的T淋巴细胞，破坏宿主免疫系统，并且诱导产生艾滋病。

病毒带有通常的gag-pol-env 区域，并且也有一些附加的读码框产生一系列重要行为，这些读码框互相重叠。

28.2 细胞内有逆转录病毒致癌基因原型序列
图28.8表示一些逆转录病毒的致癌基因。

这种类型肿瘤的产生是由特定的致癌基因及
其表达的时间地点共同决定的。

令人惊奇的是通常致癌基因的活性位于单个基因中。

但有一些例外，逆转录病毒携带多个致癌基因，如AEV。

图28.8 转化逆转录病毒都携带来一个自宿主细胞的癌基因。

病毒的名称和简写反应了它们被首次分离
出来的时间，以及它们所导致肿瘤的类型。

通过比较病毒和其亲本(非致癌的)病毒的序列，我们可描绘一个精确转化逆转录病毒中的新序列。

无一例外，都存在一个与细胞基因组序列紧密相关的新区域。

正常细胞序列本身是无致癌性的，但它含原癌基因，当被逆转录病毒捕获和修饰后产生致癌基因。

用前缀v和c分别表示病毒的致癌基因和细胞中的对基因。

如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒携带的致癌基因表示为v-src，在细胞基因组中相关原癌基因表示为c-src。

通过比较v-onc和c-onc基因可判断促使肿瘤形成的特性。

已有30多种c-onc基因通过研究它们在逆转录病毒中的取代物得到证实。

有时在不同转化病毒中有同一个c-onc基因的代表物。

例如，猴病毒ssv和猫病毒FeSV的PI株都携带来自c-sis的v-onc。

有些病毒携带相关的v-onc基因，例如MuSV的Harvey株和Kirsten 株，它们携带来自细胞c-ras基因家族两种不同成员的v-ras基因；FeSV的3种不同独立型可能起源于同一原始病毒，但分别产生出sis、fms和fes致癌基因。

一种转导病毒形成的情况是复杂的，有些病毒包含来自多个细胞基因的序列。

若转导不常发生，多种独立的分离物代表同种c-onc基因现象就很明显。

例如，几种病毒携带v-myc基因。

它们来源于同一个c-myc基因，但这些v-myc基因的精确末断和点突变处都有不同。

这表明我们鉴定的大多数c-onc基因都可被病毒转导激活。

伴随v-onc的表达发生转化现象是一个直接证据，用RSV试验发现，v-src中的温敏突变体在升高温度下可使被转化的表型回复，降温又变回突变表型。

这清楚的表明，起始和持续转化状态都需要v-src基因。

有两种理论可解释v-onc基因和c-onc基因特性的不同：
•数量模型(Quantitative model)认为：病毒基因与细胞基因功能难以区别，因为它们大量表达或在不适宜细胞型中表达或它们的表达不能关闭都能导致肿瘤。

•质量模型(Qualitative model)假设c-onc基因本身缺乏致癌基因特性，但是可由突变转换为
致癌基因。

v-onc基因与相应c-onc基因是怎样紧密联系的呢？有时，唯一的改变只是少量的点突变。

有的整个c-onc基因被病毒获得，如mos、sis和myc基因。

这样，少量氨基酸的变化似乎不影响蛋白质的功能，事实上也不是转化活性所必需的。

所以v-onc产物可能是实现类似c-onc产物的酶活性或其它功能，只是在规则上有些变化，过量表达是致癌的原因。

c-myc是一个好例子，它的致癌性由过量表达导致，这种过量表达由转化逆转录病毒携带的v-myc基因或导致c-myc过量表达的细胞基因变化引起。

有的点突变在产生一个致癌基因时起关键作用，如ras和src基因。

在ras中，激活蛋白质的Ras活性调控变化可直接产生在v-onc已发生过的点突变。

过量表达的c-ras可能有弱的致癌作用，但完全的致癌性需要蛋白质序列的改变。

有时，一个v-onc基因N或C末端被切去。

这些区域的失去可能除去某些正常限制c-onc 产物活性的限制规律。

这种序列的改变对src的致癌性产生时必需的。

v-src在低水平蛋白质时有致癌性，但c-src的C末端19氨基酸被v-src末端的12个不同氨基酸所取代，正因为如此才能激活Src蛋白质。

当v-onc基因是c-onc的剪切产物时，点突变可能也助于v-onc 产物的致癌。

在Src中，磷酸化靶位点1、2个酪氨酸残基的变化对肿瘤产生有重要影响。

转化的逆转录病毒的性质在定义致癌基因时起了重要作用。

而致癌基因是由原癌基因的激活生成的，这一概念为动物癌症提供了重要标准。

但是，许多在人类癌症中发生事件在病毒中间物中却不存在，并且其它机制也与致癌基因产生有关。

28.3 鼠原癌基因能够被突变激活
通过直接检测转导的方法可鉴定一些致癌基因。

正常的受体细胞可用动物肿瘤中的DNA杂交(事实上，已知的鼠NIH3T3成纤维细胞系被用作受体细胞)。

其过程如图28.9所示。

如果一种基因有助于转化发生，将它导入新细胞最终会使细胞转化。

另一种检测采用将细胞注入裸体(Nude)鼠(它丧失移植的免疫抗性)，于是形成肿瘤的能力便可在动物中直接观测到。

当一个细胞在3T3培养物或其它培养物中发生转化时，其后代堆积成一团。

这种聚团(Focus)现象可用于检测DNA制备物的转化能力。

从肿瘤细胞中分离出DNA制备物开始，这种聚团形成率很低。

但一旦转化基因被分离和克隆，可得到更高的转化率。

事实上，基因的转化能力可用克隆序列产生的聚团形成效率来衡量。

有转化活性的DNA只能从有肿瘤基因的细胞中分离出来，在正常DNA中不存在。

通过这种检测分离出的转化基因有两个显著性质:
•它们与正常细胞的DNA有十分相似的序列。

这表明转化是由正常细胞基因(原癌基因)突变产生致癌基因导致的。

这种变异可能是一种点突变或c-onc 基因附近大范围的DNA重排。

•它们在目前已知的转化病毒致癌基因中含有副本。

表明原癌基因花样(Repertoire)是有限的，并且这些基因可能就是突变产生癌基因或因突变形成病毒致癌基因的靶基因。

来源于c-ras家族的致癌基因，可用交叉感染检测。

这个家族包含几种人和鼠的活性
基因，在基因组中分散存在(也有许多假基因)单个基因。

N-ras、H-ras和K-ras，都紧密关联，并编码～21kD的蛋白质产物，统称为p21ras。

H-ras和K-ras基因有V-ras副本，分别由鼠科肉瘤(Murine sarcoma)病毒Harvey和Kirsten株携带(见图28.8)。

每个v-ras基因与相关c-ras基因紧密相关，只有少量氨基酸不同。

Harvey和Kirsten病毒株应起源于独立的重排，使原始病毒获得相关c-ras序列。

c-ras基因致癌的变种在病毒原始肿瘤和肿瘤细胞系制备的转化DNA中已发现。

每个c-ras原癌基因都会因单个碱基突变成为一个转化的致癌基因。

人类肿瘤中几个独立的突变通常是导致一个Ras蛋白质12位或61位氨基酸被取代。

图28.9 某些肿瘤细胞具有将正常细胞也转化为
肿瘤细胞的能力，可利用细胞的这种特性，通过
转染实验，直接分离某些癌基因。

图28.10 在正常依赖于Ras的通路中，Ras的活
性可通过控制GNRF或GAP来调控。

但在Ras
突变细胞株中，Ras持续处于有活性的状态，而
且极难转变(癌变可引起某细胞蛋白失控)。

第12位是v-H-ras和v-K-ras基因发生突变的位点之一。

所以突变发生在逆转录病毒的v-ras基因和多倍体鼠及人类肿瘤的突变c-ras基因的同一位置。

这表明正常的c-Ras蛋白质能通过鼠和人(可能任一种哺乳动物)中某一密码子突变被转化为致癌基因的形式。

由此得出一条规律：编码序列的置换可使细胞原癌基因转化为一个致癌基因。

这一致癌基因与机体中自发肿瘤的出现紧密相关。

它也可由逆转录病毒携带，这种情况下肿瘤由病毒性感染引发。

在致癌基因发生边缘，ras基因保持细微的平衡。

几乎所有发生在12或61位的突变都能使c-ras原癌基因转化为活性致癌基因。

3种c-ras基因在12位都有甘氨酸。

如果它在体外被除脯氨酸外的其它19种氨基酸任一种取代，突变的c-ras基因可转化培养细胞。

取代氨基酸的具体类型影响转化能力。