宏基因组PPT
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依赖于功能基因或编码功能蛋白在外源宿主中的表 达
能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产 生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗 菌活性的克隆子
方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直接检测；
方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选 择性条件下功能互补生长的特性进行
（3）底物诱导基因表达筛选(substrate-induced gene-expression screening，SIGEX)
原理：SIGEX 是用于能利用各种底物诱导的 分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技 术用来筛选代谢相关基因及酶基因。由于编 码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通 常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序 列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达， 反之则不表达。
第一步：以 p18GFP为载体构
优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性 好
缺点：纯度低，腐植酸等污染严重，还需要经过纯 化处理才能满足后续分子生物学操作的需要。此外， 由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小 (1—50 kb) )且多为平端，不利于建库。
（2）间接提取法
操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
欲插入目的片段的大小 所需要的载体拷贝数 使用的宿主 筛选方法
载体的选择要有利于目的基因的扩增、表达 及在筛选细胞中目标物质的表达量的调控等。
Comparison of different clone vectors
Cloning vectors
Size of inser segments
plasmid
为什么要研究宏基因组学呢？
99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微生 物世界的认识集中在不到1%的微生物上
人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养 的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的 功能的认识远远落后于对其个体的认识
二、宏基因组的研究步骤
分离特定环境生物DNA 纯化大分子量DNA进行克隆 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转
要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影 响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组 学及其相互关系的研究。
2.宏基因组（广义）
广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
率。
测序过程:
脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)
↓ DNA聚合酶 （能和DNA模板的下一个碱基配对）
添加到测序引物的3’末端
↓ （释放）
焦磷酸(PPi)
↓ ATP硫酸化酶 加入 APS ↓
特异的检测峰 ↗ （微弱光检测）
ATP→→→→氧化荧光素（产生可见）
加入荧光素
（2）基于功能的筛选方法
以活性测定为基标记的特异 核酸探针与细胞内相应 的靶DNA分子或RNA分 子杂交，通过在荧光显 微镜或共聚焦激光扫描 仪下观察荧光信号，来 确定与特异探针杂交后 被染色的细胞。
三、宏基因组的应用及研究现状
1.海洋微生物
1、海洋生物活性产物的痕量存在； 2、海洋生物活性物质难于化学合成； 3、产生活性物质的海洋微生物难于人工培养
10
λphage
24
Cosmid,fosmid 35~45
BAC
120~300
PAC
100~300
YAC
250~2000
MAC
>1000
Vector structure
Expresslion hosts
circular linear circular circular circular linear
3.宏基因组（狭义）
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
4.宏基因组学
宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用 环境样品基因组资源，获得活性物质和功能 基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍， 可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了 微生物资源的利用空间，正成为国际生命科 学研究最重要的热点之一
宏基因组 （Metagenomics）
唐荧霜 20162002016t
1 宏基因组简介 2 研究步骤 3 应用及研究现状
一、宏基因组简介
1.产生背景
人类基因组计划(human genome project，HGP)的 完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为 主的后基因组时代
人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制， 还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成 和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。
所构建的工程菌可用于处理各种复杂污染物，是非 常有前景的降解酶系基因筛选方法；
所获取的多样性信息可以在废水处理的各种反应器 系统、污染物降解过程中微生物的作用和调控、微 生物对环境和气候的监测等研究中发挥作用
分析微生物种群多样性，检测评价环境健康
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物
（4）其它筛选方法
稳定性同位素技术：
具有相同原子序数 但不同中子数目且不具 放射性的元素称为稳定 同位素(stable isotope probing，SIP)。环境中 的许多物质都可以用 SIP来标记，鉴定和分 析复杂样本中进行有特 殊代谢功能的微生物
（4）其它筛选方法
荧光原位杂交技术：
（1）基于序列的筛选方法
①.随机鸟枪法（Shotgun sequencing）
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关系 进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中的正
确位置。
优点：为筛选新的天然产物提供了一种可选 择的途径, 从中挖掘上百万个新基因,揭示不 可培养微生物的代谢途径.
大片段插入Large size (Cosmid,Fosmic libraries筛选Library screening
功能驱动法 Function–driven
screening
序列分析法 Sequence-driven
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
linear
mammalia
3.宿主系统的选择 在构建的过程中，细菌、酵母、链霉菌等为主要的宿主。 不同的宿主所产生的活性物质有明显的差异，目前构建的文 库如果筛选新的酶，采用大肠杆菌为宜；若是抗菌抗肿瘤物 质，选择链酶菌为宿主较为理想。
常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
（1）直接裂解法
操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处 理，继而提取DNA并纯化，包括：
物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法) 化学法（常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂）
酶裂解法（加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等）
宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促 使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列 及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端 环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有 十分重要的应用前景。
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复
获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。
入模式ronment samples 富集培养Enrichment Cultivation
DNA提取 DNA isolation
载体插入Vectors ligation 插入寄主Insert into the host
小片段插入Small size (plasmid)
优点： 提供了一个有效的和经济的检测手段 增加了筛选的容量和效率 为高通量筛选提供了保障
不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心 因修改底物而产生毒性
可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能
缺点： 目标基因的结构性和适应性很敏感，无法用于分析
不能进入细胞质的底物，FACS对进样设备的要求 也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都 相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他 因子的诱导，有些基因并不需要诱导，是本底水平 表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可 被诱导表达
screening
底物诱导基因 表达法SIGEX
screening
其它方法 Compound Configuration screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中
发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。
从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
2.环境保护和污染修复
可以有效地从环境中分离新的基因、在无底物情况下以异 丙基 —β-D硫代半乳糖苷（ IPTG) 基因为诱导物去除阴性 克隆和 GFP表达的克隆子；
第三步：在培养基中添加底物 诱导代谢关基因的表达；
第四步：根据 gfp基因的表达 从宏基因克隆库中筛选出表达 代谢基因的克隆子 ,利பைடு நூலகம்荧光 激活细胞分离仪 (FACS)从琼 脂培养平板上将GFP表达的克 隆子分离出来。
的其他技术。
（1）基于序列的筛选方法
根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引 物和探针，通过杂交或PCR扩增鉴定出已知基因的同 源物,进而筛选阳性克隆子
对鉴定新的基因成员有一定的局限性 ,但它已被有 效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如 16S rRNA基因 )和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合 物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等 )
缺点：耗费大,需大量人力和物力；与个体微 生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困 难。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效
宿主菌株的选择主要考虑：
1 转化效率
2 重组载体在宿主细胞中的稳定性 3 宿主能否提供必需的转录表达体系
4 对异源表达基因产物是否有较强的相容性
5 目标 ①基于核酸序列差异分析； ② 基于目的克隆功能的特殊代谢活性； ③基于底物诱导基因的表达； ④ 基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内
优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高
缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程 中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位 裂解法少10—100倍
2.载体选择
载体系统的选择取决于所提取土DNA 的质量 及研究目的，需要考虑：
能够在各种选择性平板上通过可见性状筛选的到产 生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗 菌活性的克隆子
方法一：对具有特殊功能的克隆子进行直接检测；
方法二：基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选 择性条件下功能互补生长的特性进行
（3）底物诱导基因表达筛选(substrate-induced gene-expression screening，SIGEX)
原理：SIGEX 是用于能利用各种底物诱导的 分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技 术用来筛选代谢相关基因及酶基因。由于编 码相关代谢基因或酶基因通常呈簇存在，通 常与该物质诱导的启动子和同源转录调控序 列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达， 反之则不表达。
第一步：以 p18GFP为载体构
优点：操作容易、成本低、DNA提取率高、重复性 好
缺点：纯度低，腐植酸等污染严重，还需要经过纯 化处理才能满足后续分子生物学操作的需要。此外， 由于强烈的机械剪切作用，所提取的DNA片段较小 (1—50 kb) )且多为平端，不利于建库。
（2）间接提取法
操作方法：采用物理方法将微生物细胞从环境中分 离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，如先采 用密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔 点琼脂糖中裂解，脉冲场凝胶电泳回收DNA。
欲插入目的片段的大小 所需要的载体拷贝数 使用的宿主 筛选方法
载体的选择要有利于目的基因的扩增、表达 及在筛选细胞中目标物质的表达量的调控等。
Comparison of different clone vectors
Cloning vectors
Size of inser segments
plasmid
为什么要研究宏基因组学呢？
99%以上的微生物未 (难 )被纯培养, 对微生 物世界的认识集中在不到1%的微生物上
人们对微生物的认识主要基于实验室纯培养 的单一微生物物种,对微生物群落作为整体的 功能的认识远远落后于对其个体的认识
二、宏基因组的研究步骤
分离特定环境生物DNA 纯化大分子量DNA进行克隆 将带有宏基因组DNA的载体通过转化方式转
要想了解生命的起源、本质、进化和相互作用及影 响，就必须对彼此密切相关的生物进行各个基因组 学及其相互关系的研究。
2.宏基因组（广义）
广义宏基因组是指特定环境下所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
率。
测序过程:
脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)
↓ DNA聚合酶 （能和DNA模板的下一个碱基配对）
添加到测序引物的3’末端
↓ （释放）
焦磷酸(PPi)
↓ ATP硫酸化酶 加入 APS ↓
特异的检测峰 ↗ （微弱光检测）
ATP→→→→氧化荧光素（产生可见）
加入荧光素
（2）基于功能的筛选方法
以活性测定为基标记的特异 核酸探针与细胞内相应 的靶DNA分子或RNA分 子杂交，通过在荧光显 微镜或共聚焦激光扫描 仪下观察荧光信号，来 确定与特异探针杂交后 被染色的细胞。
三、宏基因组的应用及研究现状
1.海洋微生物
1、海洋生物活性产物的痕量存在； 2、海洋生物活性物质难于化学合成； 3、产生活性物质的海洋微生物难于人工培养
10
λphage
24
Cosmid,fosmid 35~45
BAC
120~300
PAC
100~300
YAC
250~2000
MAC
>1000
Vector structure
Expresslion hosts
circular linear circular circular circular linear
3.宏基因组（狭义）
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
4.宏基因组学
宏基因组学是一种基于无需预先培养来利用 环境样品基因组资源，获得活性物质和功能 基因的新技术，因而绕过了菌种纯培养障碍， 可直接从自然界获取遗传信息，极大拓宽了 微生物资源的利用空间，正成为国际生命科 学研究最重要的热点之一
宏基因组 （Metagenomics）
唐荧霜 20162002016t
1 宏基因组简介 2 研究步骤 3 应用及研究现状
一、宏基因组简介
1.产生背景
人类基因组计划(human genome project，HGP)的 完成，从结构基因组学进入以功能性基因组研究为 主的后基因组时代
人体的生理代谢和生长发育不仅受自身基因控制， 还与其他生物基因组相关。已证明体内菌群的组成 和活动与人的生长发育、生老病死息息相关。
所构建的工程菌可用于处理各种复杂污染物，是非 常有前景的降解酶系基因筛选方法；
所获取的多样性信息可以在废水处理的各种反应器 系统、污染物降解过程中微生物的作用和调控、微 生物对环境和气候的监测等研究中发挥作用
分析微生物种群多样性，检测评价环境健康
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物
（4）其它筛选方法
稳定性同位素技术：
具有相同原子序数 但不同中子数目且不具 放射性的元素称为稳定 同位素(stable isotope probing，SIP)。环境中 的许多物质都可以用 SIP来标记，鉴定和分 析复杂样本中进行有特 殊代谢功能的微生物
（4）其它筛选方法
荧光原位杂交技术：
（1）基于序列的筛选方法
①.随机鸟枪法（Shotgun sequencing）
将一条完整的目标序列随机打断成小的片段 , 分别测序 ,然后利用计算机根据序列间的重叠关系 进行排序和重新组装, 并确定它们在基因组中的正
确位置。
优点：为筛选新的天然产物提供了一种可选 择的途径, 从中挖掘上百万个新基因,揭示不 可培养微生物的代谢途径.
大片段插入Large size (Cosmid,Fosmic libraries筛选Library screening
功能驱动法 Function–driven
screening
序列分析法 Sequence-driven
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
linear
mammalia
3.宿主系统的选择 在构建的过程中，细菌、酵母、链霉菌等为主要的宿主。 不同的宿主所产生的活性物质有明显的差异，目前构建的文 库如果筛选新的酶，采用大肠杆菌为宜；若是抗菌抗肿瘤物 质，选择链酶菌为宿主较为理想。
常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
（1）直接裂解法
操作方法：将环境样品直接悬浮在裂解缓冲液中处 理，继而提取DNA并纯化，包括：
物理法(如冻融法、超声法、玻璃珠击打法、液氮研磨法) 化学法（常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂）
酶裂解法（加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等）
宏基因组工程与海洋生物学进行有机的结合，促 使人类了解许多为培养海洋微生物的基因组序列 及其功能产物，在海洋天然药物研究、海洋极端 环境微生物研究、海洋微生物多样性探索中具有 十分重要的应用前景。
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复
获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。
入模式ronment samples 富集培养Enrichment Cultivation
DNA提取 DNA isolation
载体插入Vectors ligation 插入寄主Insert into the host
小片段插入Small size (plasmid)
优点： 提供了一个有效的和经济的检测手段 增加了筛选的容量和效率 为高通量筛选提供了保障
不需要对在颜色筛选中使用的底物进行修改，勿需担心 因修改底物而产生毒性
可以从底物来推断得出未知的酶，继而推断基因的功能
缺点： 目标基因的结构性和适应性很敏感，无法用于分析
不能进入细胞质的底物，FACS对进样设备的要求 也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都 相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他 因子的诱导，有些基因并不需要诱导，是本底水平 表达的，有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可 被诱导表达
screening
底物诱导基因 表达法SIGEX
screening
其它方法 Compound Configuration screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中
发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。
从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
2.环境保护和污染修复
可以有效地从环境中分离新的基因、在无底物情况下以异 丙基 —β-D硫代半乳糖苷（ IPTG) 基因为诱导物去除阴性 克隆和 GFP表达的克隆子；
第三步：在培养基中添加底物 诱导代谢关基因的表达；
第四步：根据 gfp基因的表达 从宏基因克隆库中筛选出表达 代谢基因的克隆子 ,利பைடு நூலகம்荧光 激活细胞分离仪 (FACS)从琼 脂培养平板上将GFP表达的克 隆子分离出来。
的其他技术。
（1）基于序列的筛选方法
根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引 物和探针，通过杂交或PCR扩增鉴定出已知基因的同 源物,进而筛选阳性克隆子
对鉴定新的基因成员有一定的局限性 ,但它已被有 效地用于鉴定系统发育学中的标志基因(如 16S rRNA基因 )和带有高度保守域的酶基因(如聚酮化合 物合成酶、葡萄糖酸还原酶和腈水合酶等 )
缺点：耗费大,需大量人力和物力；与个体微 生物基因相比,对序列片段进行分析则极为困 难。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效
宿主菌株的选择主要考虑：
1 转化效率
2 重组载体在宿主细胞中的稳定性 3 宿主能否提供必需的转录表达体系
4 对异源表达基因产物是否有较强的相容性
5 目标 ①基于核酸序列差异分析； ② 基于目的克隆功能的特殊代谢活性； ③基于底物诱导基因的表达； ④ 基于包括稳定性同位素和荧光原位杂交在内
优点：可获得大片段DNA(20—500 kb)且纯度高
缺点：操作繁琐，成本高，有些微生物在分离过程 中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物 DNA 也不容易抽提出来。所获得的DNA产率比原位 裂解法少10—100倍
2.载体选择
载体系统的选择取决于所提取土DNA 的质量 及研究目的，需要考虑：