第七章1 生物质谱技术

缺点
分辨率低； 1000Da以下基质峰干扰； 激光解吸附离子化有可能使样品光降解； 不能分析非共价键相互作用； 如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。
Wolfgang Paul 1989 Nobel Prize for Physics "for the development of the ion trap technique"
John Bennet Fenn 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (ESI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
④ 场解析电离源（FD）
过程：样品溶液涂于发 射器表面—强电场—加 热致分子解吸电离 特点：特别适于非挥发 性的高分子。样品只产 生分子离子峰和准分子 离子峰，碎片峰很少， 谱图最为简单。
EI
FI FD 32
⑤ 快原子轰击(Fast atom bombardment, FAB)
过程：惰性气体（如氙或氩电离）通过电场加速获得高动 能——快原子——快速运动的原子撞击涂有样品的金属 板——金属板上的样品分子电离——二次离子——电场作 用下，离子被加速后——通过狭缝进入质量分析器。
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⑥ 电喷雾电离（Electrospray ionization，ESI） 工作原理:
样品溶解在溶剂中，溶液从毛细管流出时,在电 场及辅助气流作用下喷成雾状的带电微液滴,在加热 气体作用下,液滴中溶剂被蒸发,导致液滴体积变小, 表面电荷密度增加，当液滴表面电荷产生的库仑排斥 力与表面张力大致相等时,液滴爆裂为更小的带电微 滴，此过程不断重复，直至样品以离子方式从液滴表 面蒸发，进入气相。
The Five Mass Spectrometry Nobel Prize Pioneers
Joseph John Thomson 1906 Nobel Prize for Physics "in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases"
质谱已成为肽和蛋白分析的重要工具,主要归功 于一些软电离技术的应用,如电喷雾( ESI) 和基 质辅助激光解吸电离(MALDI)。
生物大分子多为极性、难挥发化合物,不易气化, 用传统质谱无法测定，依赖新技术。
当前，生物质谱仪器的主要进展在于
① 如何测定大质量分子的质荷比 ② 如何扩大质谱仪器的质量测定范围 ③ 如何使生物大分子电离和使其多带电荷 ④ 如何解释大质量分子质谱 ⑤ 如何发展生物大分子质谱测定方法。
⑦ 基质辅助激光解吸电离（MALDI）
工作原理： 将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供
的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一 部分能量传递给样品分子使其离子化。
337 nm UV laser
特点：
cyano-hydroxy cinnamic acid
MALDI
MALDI的进样是固相方式，对杂质的忍耐性较好；
z e U = 1/2 mV2
样品必须带电荷才能够进入质谱被检测，中性的 物质是不能进入质谱被检测的
MS Principles
Sample
+ _
Ionizer
Mass Analyzer
Detector
2.质谱仪的基本组成
质谱仪一般由进样装置、离子源室、质量分析器、离 子检测器、数据分析系统、真空系统和供电系统组成。 离子源、质量分析器和检测器必须处于高真空状态。
20世纪60年代，四大光谱分析，质谱分析法研究 的相对分子量只在几千左右；
80年代左右，随着快原子轰击（FAB）、电喷雾 （ESI）和基质辅助激光解析（MALDI）等新“软 电离”技术的出现，质谱能用于分析高极性、难 挥发和热不稳定样品。
90年代，蛋白质组学概念的出现，使得质谱技 术成为蛋白质组学研究中的支撑技术。
现代质谱仪具有电离蛋白质及其它一些生物大分 子的能力，具有高效、灵敏、准确、自动化、可 同时分析多蛋白混合物等特点；已逐步取代了传 统的Edman降解测序与氨基酸组份分析法，成为 蛋白质鉴定的核心技术
二、质谱基本原理和工作模式
1.基本原理
质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷 比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中， 其动能与加速电压及电荷z 有关，即:
3.进样方式
(1)间歇式进样 主要用于一般气体和挥 发性液体样品的分析， 加热后蒸发，利用压力 梯度使试样蒸汽进入离 子源（上图）。
(2)探头进样系统 一些热不稳定或难以汽 化的样品不适宜于采用 加热进样系统，可用探 头进样法（下图）。
(3)色谱进样系统 色谱--质谱联用的仪器可以分析混合物，由色谱 进样分离，然后进入质谱计的离子源中。
Koichi Tanaka 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (MALDI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
甲烷离子与分子反应生成加合离子： CH4+＋CH4 →CH5+＋CH3 CH3+＋CH4 →C2H5+＋H2
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加合离子与样品分子反应：
CH5+ ＋M→MH+＋CH4 C2H5+ ＋M→MH+＋C2H4
(M+1)+
CH5+ ＋M→(M-H)+＋CH4 +H2 C2H5+ ＋M→(M-H)+＋C2H6
4.离子源（ion source）
离子源作用是将样品分子转变为气态的离子化的分子。 硬源：离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，
可得到分子官能团的信息； 软源：离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得
到分子离子峰，即得到分子量信息。
常用离子源：
（1）气相离子化源：将试样气化后再离子化 电子轰击电离源（EI）、化学电离源（CI）、场致电 离源（FI）
(M-1)+
复合反应：
CH5+ ＋M→(M+CH5)+
(M+17)+
C2H5+ ＋M→(M+C2H5)+＋C2H4 (M+29)+
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EI和CI所获得到质谱图比较
电离能小，质谱峰数 少，图谱简单； 准分子离子(M+1)+峰 大，可提供分子量这 一种要信息； 不适用于难挥发，热 不稳定或极性较大的 有机物分析。
Francis William Aston 1922 Nobel Prize for Chemistry "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule"
• Expansion of matrix at supersonic velocity, analyte trapped in expanding matrix plume (explosion/”popping”)
优点
质量数可达300,000Da； 10-15 至10-18级灵敏度； 软电离方式，无或极少碎片离子； 耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）； 适于分析复杂混合物。
形成多电荷分子离子，使得m/z大大减小，检测分子 质量可达150kDa。
Fra Baidu bibliotek点：
测定分子质量高； 灵敏度极高（10-15mol）； 易于和LC串联； 没有基质干扰； 带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的
离子，通过计算平均值给出更精确的质量数；
缺点：
耐盐能力低； 对某些化合物特别敏感，污染难清洗； 样品需先气化； 带多电荷，在分析混合物时，产生混乱； 定量时需内校准。
形成单电荷分子离子。
+
+-
-
+ +
-
Matrix Laser
Analyte
+
+ ++ -+
+---+
+
+ +
++
• Absorption of UV radiation by chromophoric matrix and ionization of matrix
• Dissociation of matrix, phase change to super-compressed gas, charge transfer to analyte molecule
② 化学电离源(Chemical Ionization, CI)
离子源内充满一定压强的 反应气体(甲烷等)，与 样 品 比 例 约 为 104:1 ， 高 能电子轰击使反应气体 电离，再与式样分子反 应生成准分子离子。
甲烷首先被电离： CH4+ →CH4+＋CH3+＋CH2+＋CH+＋C+＋H+
生物质谱技术获得2002年诺贝尔化学奖
质谱（Mass spectrometry）
被离子化的样品形成的分子离子及其碎片，在 电场或磁场的作用下，按质荷比（或质量）的大 小顺序排列并记录下来的质量谱。
质谱仪 是一类能使物质粒子离子化并通过适当的电场、
磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定 的程度实现质荷比分离，并检测它们的强度的一 类仪器。 主要由电学系统、分析系统和真空系统组成。
高能电子束产生的分子离子M+，将进一步裂解，释 放出部分能量，产生质量较小的碎片离子（正离子） 和中性自由基：
M1+ + N1· M+
M2+ + N2 ·
特点：
属于硬电离源； 结构简单，操作方便； 电子轰击能量高，生成许多碎片离子； 对极性大、热不稳定的大分子有机物，难以得到完整 的分子离子信息
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③ 场致电离源（FI）
应用强电场诱导样品电离： (电压：7～10kV，d<1mm) 过程：样品蒸汽邻近或接触 强电场阳极尖端时,由于高 曲率半径的尖端处产生很强 的电位梯度,使样品分子电 离.
FI与EI所产生的质谱图对比
FI特点：电离温和，碎片少，主要产生分子离子M+和 (M+1)+峰。
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（2）解吸离子化源：将液体或固体试样直接转变为气 态离子 场解析电离源（FD）、快原子轰击电离源（FAB）、 激光解析电离源（LD）、电喷雾电离源（ESI）等。
① 电子轰击电离(Electron Bomb Ionization，EI)
采用高速(高能)电子束冲击样品，从而产生电子和分 子离子M+：
M + e → M+ + 2e
正、负离子模式
碱性化合物（胺类化合物，如蛋白质）易带正 电荷，加合质子或其他正电荷离子；酸性化合物 （羧酸化合物，如核酸）易带负电荷，失去质子 或加合其他负电荷离子。
通过调节毛细管电场的方向可以分别实现正、 负离子的检测。
特点：
采用液相方式进样，可与液相色谱联用，蛋白质多肽 经HPLC分离后，可直接进入质谱进行分子量测定；
回顾与总结
• 离子交换层析：原理、离子交换剂选择 • 亲和层析：原理、载体、配体 • 高效液相层析：分类
第七章 生物质谱技术与蛋白质鉴定
第一节 生物质谱技术 一、质谱发展概述 二、质谱基本原理和工作模式 三、质谱分析的主要指标及离子峰的类型 四、生物质谱技术
第二节 蛋白质鉴定 一、肽质量指纹谱鉴定蛋白质 二、串联质谱
一、质谱仪的发展史
世 界 上 第 一 台 质 谱 仪 于 1 9 1 2 年 由 英 国 物 理 学 家 Joseph John Thomson（1906年诺贝尔物理学奖 获得者、英国剑桥大学教授）研制成功；
20世纪20年代，质谱逐渐成为一种分析手段，被 化学家采用；从40年代开始，质谱广泛用于有机 物质分析
进样 系统
离子源室
质量分析 器
检测 器
数据 处理
真空系统 供电系统
离子化源和质量分析器是核心部件，不同类型的质谱 仪主要依据两个部件来命名，如电喷雾（ESI）、基 质辅助激光解吸电离(MALDI)是根据离子化源不同来 区分，而飞行时间质谱、四级杆质谱则是根据质量分 析器来划分。
不同的离子源和质量分析器相匹配，基本确定了质谱 仪的工作方式。