实验三血红蛋白(Hb)及全血尿素氮

实验三血红蛋白（Hb）及全血尿素氮的测定

一、血红蛋白的测定（氰化高铁血红蛋白法）

血红蛋白（Hb）是一种结合色蛋白，色素部分是亚铁血红素，蛋白质部分是珠蛋白。1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。

Hb的主要生理功能是：1、运输氧气（O

2）和二氧化碳（CO

2

），2、缓冲作用。

每分子的Hb可结合4分子的氧气，在标准的情况下（0℃，1个大气压），每克

Hb能结合1.39毫升氧气。HbO

2

比Hb具有较强的酸性，例如，在红细胞中，1毫

摩尔的HbO

2

能产生1.88毫克当量的氢离子（H+），而1毫摩尔的Hb只能产生1.28

毫克当量的H+。因此，在组织中，每放出1毫摩尔O

2

（体积22.4毫升），就能多结合0.60毫克当量的。因而Hb在调解体内酸碱平衡也有一定的作用。所以，在

运动训练和比赛中，Hb不仅能为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO

2

，而且也能起中和酸性的作用。

调查研究认为：正常人与运动员Hb含量没有明显差异。故Hb的正常值男性为120-160克/升；女性110-150克/升。贫血仍采用临床标准，即成年男性低于120克/升；成年女性低于105克/升；14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120克/升作为贫血标准。

Hb在运动训练的不同阶段，其含量不完全相同，这与运动员的机能状态、训练水平及遗传因素等关系密切。因此，系统测试Hb的含量，对于评定运动员的机能状态和运动员选材等具有重要的意义。

（一）实验目的

1、学习血红蛋白的生物学功能及在运动训练中的作用

2、学习超微量血红蛋白的测定方法及原理，熟练掌握试管、相关仪器的操作技能

（二）实验原理

Hb被高铁氰化钾[K

3Fe(CN)

6

]氧化成高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子（CN-）

结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN），它在540nm有一吸收峰，测定其光密度，与标准血红蛋白进行比较，而得到Hb的含量。

（三）实验试剂和仪器

1、试剂：

（1）HiCN 稀释液：称取高铁氰化钾[K 3Fe(CN)6]200毫克，氰化钾（KCN ）50

毫克，磷酸二氢钾（KH 2PO 4）140毫克，加蒸馏水稀释至1升。此试剂应呈透明、

淡黄色，PH 在7.0-7.4之间，如不到此范围，可用NaOH 调整。以蒸馏水作为空白，在540nm 比色，读数也是零。此液应置于棕色试剂瓶中，放在室内阴暗处或冰箱4。C 以上，可保存数月，注意不能冷冻。

（2）75%的酒精

2、仪器：

分光光度计、一次性采血针、一次性采血管（20微升）、消毒棉球、10毫升试管

（三）实验操作

测定管（带塞刻度试管）

氰化高铁血红蛋白稀释液5ml a1

酒精消毒手指，并采取新鲜血液0.02ml

混匀后放置3-5分钟

540nm 比色,空白调零读取测定管光刻度值(OD 测)

（四）计算：

Hb 含量（克/升）= F 值 测定管光密度值

F 值=标准管血红蛋白含量（克/升）/标准管光密度=36.8

（五）注意事项

1、高铁氰化钾法测定血红蛋白比较准确、稳定，是目前国际承认的标准，但试剂中有氰化钾，剧毒，在试验进行过程中避免污染，试验完毕注意药品的处理，不能乱倒。

2、取血部位和取血时间对血红蛋白的影响较大，但最好固定在早晨起床前取样，固定在一个部位（如手指）。同时，取血时注意擦干手，消毒，用挤出的第二滴血。

二、超微量全血血尿素氮的测定（二乙酰一肟法）

尿素是体内蛋白质、氨基酸分解代谢的终产物。在生命活动中，蛋白质是不断进行代谢，蛋白质水解生成氨基酸，氨基酸经脱氨基作用所生成的氨，对于人体来说，是一种有毒物质，在它排出体外之前，必须经过肝脏的鸟暗算循环转化为尿素（无毒物质）才能排出体外。

研究证明，血尿素的含量与运动量及集体的恢复状况有关，也与肝功能、训练水平、身体机能的适应程度和蛋白质代谢有关。因此，测定血尿素的意义在于协助教练员了解运动量是否适宜、运动员训练水平的高低、机能的适应性程度和体内在特定条件下的蛋白质代谢水平。

（一）实验目的

1、学习尿素的生成原理及意义

2、学习超微量全血尿素氮的测定方法及原理，熟练掌握试管、相关仪器的操作技能

（二）实验原理

血液中的尿素在强酸的条件下与二乙酰一肟共热反应，生成红色复合物（即Fearon 氏反应）。和经同样处理的标准液比色，即可求出血液中尿素氮的含量。

二乙酰一肟+H 2O

二乙酰+羟胺 二乙酰+尿素二嗪衍生物（红色）

（三）实验试剂及仪器

1、实验试剂

（1）10%三氯醋酸

（2）二乙酰一肟液（二乙酰一肟——氨基硫脲，代号DAM-TSC ）:称

取二乙酰一肟600mg ，硫氨脲30mg ，加蒸馏水溶解至即成100ml 。存入棕色瓶中，此液久置冰箱有结晶析出，影响显色，最好使用期不超过一个月。

（3）混合酸液：浓磷酸(85-87%)35ml, 浓硫酸(95-98)80ml,慢慢滴入

800ml 蒸馏水中,冷却后加水至1000ml 。

（4）尿素氮标准储存液（1mg 氮/ml ）,将尿素(AR)置硫酸干燥器内48

小时，然后精确称取2.143g，用0.01N硫酸溶解稀释至1000ml，置冰箱内保存。

（5）尿素氮标准应用液（0.01mg氮/ml）：吸取尿素氮标准液1ml，加0.01N硫酸溶解稀释至100ml，置冰箱内保存。

2、实验仪器

分光光度计、离心机、采血针、吸血管、消毒棉球、移液管，离心管、试管、沸水浴装置。

(四)实验操作步骤

测定管（离心管）

加入0.48ml蒸馏水 C1

新鲜血液0.02ml,摇匀

加入0.5ml10%三氯醋酸 C2

离心10分钟(3000转/分)

取0.5ml上清液至带塞刻度试管 C3

加0.5ml二乙酰一肟液 C4

加混酸4ml,混匀加盖沸水浴10分钟 C5

冷却,500nm比色,空白管调零读取测定管光密度值(OD测)

(五)计算公式

尿素氮（mg%）= OD测/OD标χ50

尿素（mg%）=2.14χ尿素氮

单位转换：mg%/6=mmoL