单细胞分析研究进展

2017年1月 January 2017

Chinese Journal of Chromatography

Vol.35 No.1

105〜109

邹汉法研究员纪念专辑（下）•专论与综述

DOI: 10.3724/SP.J. 1123.2016.08039

单细胞分析研究进展

石蒙1’2，宋志花u ，耿旭辉、

吴大朋\关亚风^

(1.中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，

辽宁大连116023; 2.中国科学院大学，北京100049)

摘要:单细胞分析可以揭示生命基本单元—细胞物质组成、生理行为的多样性和差异性，是当今生命分析的主流

前沿技术。同时，也对分析技术的定量检测极限、分辨率和精密操控能力提出了新挑战。文章着重从单细胞分离、 检测、成像等几个主要方面，综述了单细胞技术研究的最新进展，并对分离和检测技术的发展作了展望。关键词:单细胞;分离;检测;成像;综述中图分类号:〇658 文献标识码:A 文章编号：1000-8713( 2017) 01-0105-05

Latest developments of single cell analysis

SH I M e n g 1，2, S O N G Zhihua12, G E N G X u h u i 1，W U D a p e n g 1，G U A N Y a f e n g 1* *

(1. K ey Laboratory o f Separation Science f o r A n a lytica l C h e m istry ，D alian In stitu te o f C hem ical P h y s ic s ，

C hinese A ca dem y o f S c ie n ce s，

D alian 116023，C hina;

2. U n iversity o f C hinese A cad em y o f S c ie n ce s，B e ijin g 100049, C hina)

A b s t r a c t ： Single cell analysis can reveal the cellular c o m p o n e n t s a n d physiological behavior diversity. It is o n the cutting-edge of bio-analytical chemistry. Challenges o n detection limit ， resolution ，a n d precise manipulation of cells are really tougher than ever before. This review includes the developments of several m a i n techniques about separation ，detection a n d imaging. At last ，the future developments in separation a n d detection are discussed.K e y w o r d s ： single-cell ； separation ； detection ； imag i n g ； review

细胞是生物体形态结构和生命活动的基本单 位。细胞在增殖、分化和代谢的过程中内因和外因 共同作用，造就了细胞之间的差异性。即使是同源 的两个细胞，细胞内物质组成和含量也会有很大差 异[1]。而群体细胞分析只能给出一个稳态的平均 结果，无法表征细胞间的差异性。因此，在单细胞水 平上对细胞中物质组成及细胞形态进行研究，对揭 示细胞间的差异性和解释某些生理行为具有重大 意义。

单细胞分析技术应具备高灵敏度、高选择性、高 时空分辨等特点，原因如下：（1)单细胞的尺寸小。 一般哺乳动物细胞的直径约为10〜20 ^m ，体积在

p L 级;植物细胞的直径在〜100 ^m ，体积在〜1 n L 。

如此小的尺寸给单细胞的获取和样品前处理操作造 成极大的困难。（2)单细胞中的物质含量极低

(z m o l ~ f m o l )，这就需要更加灵敏的检测方法。 (3)单细胞中组分十分复杂,组分之间的浓度差异

较大,跨度达9个数量级[2]，因此存在基质干扰问 题，进一步增加了检测难度。（4)细胞在新陈代谢 的过程中一直在不断地变化，需要具有高时空分辨 的技术来反映细胞的实时变化。

近来，细胞研究已深人到亚细胞甚至单分子水 平。本文着重在分离（高效液相色谱、毛细管电 泳）、检测（激光诱导荧光、质谱、电化学）、成像（超 分辨显微成像、拉曼光谱成像）等几个主要方面对 单细胞分析技术的进展进行综述，并作简要展望。

1分离技术

细胞内源物质组成极度复杂且浓度范围极宽, 例如最简单的血红细胞也包含数千种物质，浓度范

收稿日期：2016-08-31

* 通讯联系人.Tel:(0411)84379590,E-mail:guanyafeng@ .

基金项目：国家自然科学基金项目（21405157)；中国科学院重点部署项目（KFZD-SW-203,SW-203-03).

Foundation ite m ： National Natural Science Foundation of China (No. 21405157) ； Key Program of the Chinese Academy of

Sciences (Nos. KFZD-SW-203,

SW-203-03).

•106-色谱第35卷

围跨度达9个数量级[2]。若要检测细胞内痕量分子 甚至数个分子，必须消除基质干扰，而分离是实现复 杂体系中目标物质定量检测的前提。

1.1高效液相色谱(H P L C)

高效液相色谱由于具有较高的分离效率，一直 被广泛应用于复杂生物样品分析。最初,Jorgenson 等[3]利用毛细管开管柱液相色谱对单个神经元细 胞进行分离，并利用电化学方法检测其中的神经递 质。随后，他们又利用微柱液相色谱技术对单个牛 肾上腺骨髓细胞中的去甲肾上腺素、肾上腺素、苯乙 醇胺、，甲基转移酶等物质进行分离检测[4]。Y u 等[5]采用H P L C/E S I-M S/M S技术实现了单细胞中 谷胱甘肽的测定。超长微柱液相色谱也已用于单细 胞的分离分析:C h a等[6]利用创建的一维和二维多 孔层开管毛细管柱-电喷雾质谱分析平台进行蛋白 质组学分析。宫颈癌细胞中的237个肽段以及163 个蛋白质被成功鉴定。此外，毛细管填充柱、整体 柱、开管柱液相色谱技术等都被陆续应用于单细胞 分析。综合色谱柱样品容量和总分离效率,柱内径 为50 甚至更小、总柱效為3万塔板的微柱，才可能为低浓度目标组分的分析提供基本的分离条件。

1.2毛细管电泳（C E)

毛细管电泳技术具有很高的分离效能,可对单 细胞内复杂组分实现高效分离。由于毛细管电泳的 进样体积与细胞体积相当，并可以与电化学、激光诱 导荧光、质谱等检测技术联用,使之成为单细胞分析 的有力工具[7’8]。W i g h t m a n等[9]将毛细管电泳和 快速循环伏安法相结合，可以对单个细胞所释放的 神经递质进行检测。N e m e s等[|0]利用C E-E S I-M S 技术,对海蜗牛神经细胞中50种内源化合物进行了 分离鉴定，并对6种神经元细胞代谢物的相似度进 行评价。随后，N e m e s等[||]又采用C E-E S I-M S (T O F)平台对海蜗牛和小鼠神经元细胞中的300 种代谢物进行分离鉴定，充分揭示了不同类型神经 元细胞间的代谢物差异。此方法还可应用于细胞器 内的代谢物定量分析。随后S w e e d l e r研究组[|2]又 利用C E-E S I-M S平台对海蜗牛神经元细胞中的15 种内生核酸及其衍生物分离后进行定量检测。此方 法对于三磷酸腺苷等物质具有良好的分离重现性和 较高的灵敏度。D o v i c h i研究组[|3]采用二维电泳对 单个小鼠巨噬细胞中的多种蛋白质实现了快速分 离，对相关蛋白质的检出限达z m o l，并揭示了细胞 间组分表达的差异。微流控芯片与电泳技术结合,可以将单细胞样品前处理步骤包括细胞的获取、进样、融膜、电泳分离集成于一个微小的芯片上，极大 地提高了单细胞分析的自动化操控水平[|4]。Mel- lors等[|5]发展了一种自动化的单细胞分析芯片，将 其与E S I-M S相结合，从血红细胞中成功分离出血 红素和a亚基，检测通量可以达到丄2细胞/m i n。Z a r e等[|6]所制作的微流控芯片可以对哺乳动物单 细胞内蛋白实现单分子计数，也可对单个蓝藻细胞 中的艮肾上腺素能受体进行定量分析。毛细管电 泳与质谱联用技术的进一步发展，也将为单细胞内 组分鉴定带来促进作用[|7，|8]。毛细管电泳技术在 20世纪90年代开始被用于单细胞分析，但由于其 重现性较差，因此发展较慢。将此技术与微流控芯 片相结合可以极大地提高分析的重现性和分析通 量。有些高度集成化的微流控芯片可以连续实现单 细胞筛选、捕获、标记、分离与检测等操作。但芯片 上的毛细管电泳柱分离柱效是有限的，所以，将芯片 与传统毛细管电泳结合可有效解决实际样品分析问 题[|9]。

2检测技术

单细胞中目标物质的绝对量通常很低,一般在 f g以下,甚至是z g水平。因此，高灵敏检测是单细 胞分析的必要条件。其中，激光诱导荧光、质谱、电化学检测最为常见。

2.1激光诱导荧光检测技术

激光诱导荧光（L I F)具有极高的灵敏度，是特 殊搭建的高灵敏检测装置，其检测极限可达单分子 水平[20]，但是多数科研级L I F的检测下限是30〜丄00个荧光分子，且搭建高灵敏度激光诱导荧光检 测器的成本较高。D e n g等[2|]构建了毛细管电泳-激光诱导荧光检测（C E-L I F)分析系统，用于探究单 个癌细胞对阿霉素（D O X)的吸收行为，研究结果表 明：细胞群体内单个细胞对D O X的吸收含量存在 较大差异性，R S D值在24. 0%〜6L P/。之间。Y a n g 等[22]采用C E-L I F技术对单细胞所释放的一氧化氮 进行检测，检出限可达42 a m o l。W a n g等[23]利用 C E-L I F分析细胞中的脂质代谢物，对于荧光标记的 鞘脂类和多磷酸肌醇化合物的检出限可达到W|S〜⑴-20 m o l，并且该方法显示了较高的重现性。Z h a n g 等[24]用抗原-异硫氰酸荧光素复合物对细胞中的干 扰素进行标记，利用C E-L I F进行分离检测，能够定 量检测单个自然杀伤细胞（natural killer cell)中的 两种干扰素，检出限达z m o l。随着衍生化试剂和光 学检测系统的不断完善,L I F 将具有更高的灵敏度