昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良

*基金项目:国家高技术研究与发展计划（863）项目（2001AA214051）和国家自然科学基金项目（30080001）。

裴

炎:男，1948年生，博导，教授。E-mail:.

收稿日期：2002-10-11接受日期:2002-12-21

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2003,11(3):221~226

·专家论坛·

昆虫病原真菌致病寄主的机制和基因工程改良*

裴

炎方卫国

张永军

（西南农业大学生物技术研究中心，重庆400716）

摘要：随着大量施用化学农药所造成的环境污染等问题日益突出，真菌杀虫剂的研究和开发受到了广泛的关注。由于存在击倒昆虫时间较长、对环境条件要求高等缺点，昆虫病原真菌的广泛应用受到限制。因此，有必要弄清昆虫病原真菌致病寄主过程的遗传学和分子生物学机理，找出控制毒力的主效基因。在此基础上，利用基因工程和细胞工程等技术提高菌株毒力，创造出更适合市场需要的真菌杀虫剂。文章重点介绍了近年来有关昆虫病原真菌致病机理的研究进展，

包括侵染寄主过程中附着胞的形成、降解昆虫体壁的分子机理和昆虫病原真菌的毒素等。同时，还介绍了昆虫病原真菌的遗传转化方法和基因工程改良的一些新进展。

关键词：昆虫病原真菌；致病机理；菌株改良；基因工程

Mechanism of Fungal Pathogenesis in Insect and

Strain Improvement by Gene Engineering

Pei Yan Fang Weiguo Zhang Yongjun

(Biotechnology Research Center ，Southwest Agricultural University ，Chongqing 400716，

China)

With the increasing of widely polluted environmental concerns and health risks associated with the use of synthetic

chemical insecticides,research and development of mycoinsecticide have been paid much attention to.However,there are some barriers to exploit entomopathogenic fungi further because of their poor performance in field.In order to widen the acceptance of mycoinsecticide products in market,the molecular biology basis of fungal pathogenesis in insect should be elucidated to identify important virulent genes,which could be then used to improve the strain performance by genetic engineering.In this paper,molecular basis of appresorium formation,cuticle degrading and the role of toxins in fungal pathogenesis in insect were introduced.Meanwhile,the gene transferring methods and its usage in strain improvement of entomopathogenic fungi were also

summarized.

entomopathogenic fungi;entomopathogenicity;strain improvement;genetic engineering

随着大量使用化学合成农药所造成的环境污染

和害虫抗药性提高等问题日益突出，生物防治越来越受到重视[1]。昆虫病原真菌是自然界中昆虫种群数量得以控制的主要因素之一[2]。与其它生防微生

物相比，昆虫病原真菌具有主动侵染、

寄主不易产生抗性和可观的扩散效果等特点，因此，昆虫病原真菌作为一种潜力巨大的生物防治工具而倍受关注。目前，用于害虫生物防治的昆虫病原真菌涉及半知菌亚门（Deuteromycotian ）和接合菌亚门（Zygomycotina ）的数百个种，其中球孢白僵菌

（）、金龟子绿僵菌

（）等10余种应用较广，并有了商业产品[3]。

虽然昆虫病原真菌得到了广泛的应用，但仍存在击倒时间长和防效易受环境影响等缺点。为充分挖掘昆虫病原真菌的应用潜力，必须阐明它们致病昆虫的分子机制[4]。近年来，昆虫病原真菌特别是金龟子绿僵菌致病机理方面的研究有了长足的进展。利用基因工程等手段对昆虫病原真菌进行改造，获得安全、高效的真菌杀虫菌剂，已成为可能。本文将着重介绍近年来有关昆虫病原真菌致病分子机理和基因工程改良的重要进展和前景。

1昆虫病原真菌侵染的分子机理

农业生物技术学报2003年

昆虫体壁可以分为外表皮、前表皮、后表皮和皮脂层4层。外表皮很薄，主要由蜡质层和鞣化的蛋白质组成。前表皮和后表皮主要有几丁质骨架和填充在其间的蛋白质组成的坚固的昆虫骨骼。昆虫病原真菌则通过产生水解酶和机械压力来穿透寄主的体壁。

昆虫病原真菌从分生孢子萌发开始侵染到菌体重新在虫体上产生孢子的过程，可分为如下几个步骤：孢子粘附在昆虫体壁上；孢子萌发并产生侵染结构；菌丝穿透昆虫体壁；菌体在昆虫的血腔中生长；导致昆虫死亡；菌丝在虫体上长出并形成孢子。相对而言，金龟子绿僵菌穿透昆虫体壁这一步研究得较为详细。昆虫病原真菌的致病机制，尤其在侵染结构形成、入侵宿主和毒素介导宿主死亡等方面与一些植物致病真菌相似。了解这些过程将为选择和改良菌株提供理论依据。

1.1附着胞的形成

和许多植物致病真菌一样，昆虫病原真菌的分生孢子在宿主的体表经常分化出附着胞（appresso-rium）。附着胞的功能就是提供机械压力和分解的体壁降解酶帮助侵染钉穿透昆虫体壁。在金龟子绿僵菌、球孢白僵菌等大多昆虫病原真菌中，附着胞的产生对于建立病原与宿主之间的关系是至关重要的[5]。

胞内第二信使Ca2+和环腺苷酸（cAMP）参与附着胞形成。这些信号转换路径的一些成分已经从金龟子绿僵菌中鉴定出来[5]。St Leger等[6]提出，附着胞的形成与Ca2+浓度梯度被破坏从而激活一种离子通道相关。当附着胞开始形成时，cAMP水平会大幅度地上升。一种依赖cAMP的蛋白质激酶(PKA)的调节亚基已经从金龟子绿僵菌中鉴定出来，添加PKA抑制剂H8会选择性地抑制附着胞的形成[6，7]。离体条件下cAMP在附着胞发育中的作用同样在稻瘟病菌中被证实。已经从中克隆出了基因。破坏这一基因会特异性地阻止附着胞的形成，但对菌丝生长、产孢和有性生殖没有影响[8]。

附着胞的形成可能还有其它的一些可能的信号传导途径，例如，昆虫病原真菌与植物和动物的病原真菌一样都可能存在促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径[9]。另外，在植物病原真菌中，疏水蛋白对附着胞的形成也有较大影响，MPG1被破坏的稻瘟病菌菌株的附着胞形成的效率和毒力都降低[10]。在金龟子绿僵菌中克隆了有疏水蛋白的基因，但是它的功能有待进一步研究[11]。1.2分解寄主外壳的水解酶

昆虫病原真菌通过机械压力和水解酶的水解作用穿透昆虫体壁。相对昆虫体壁的组成成分，病原真菌产生的水解酶有几丁质酶、蛋白酶和脂酶等。目前，对脂酶的作用了解不多，蛋白酶的作用研究得较为清楚，几丁质酶次之[12]。

1.2.1蛋白质降解酶在附着胞和以昆虫体壁为唯一碳氮源的诱导培养基中有多种蛋白酶的表达，这些蛋白酶可分为两大类。其一是对底物短肽Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-Nz具有活性，包括Pr1（类枯草杆菌蛋白酶）；另一类是对短肽Ben-Phe-Val-Arg-NA有活性的蛋白酶，包括Pr2（胰蛋白酶）。Cole等[13]报道的Pr4后来被证明是Pr2的同工酶。

用组织免疫定位法证明，Pr1类蛋白酶是在附着胞和穿透寄主体壁的早期就有高水平表达，Pr1在侵染2h后大量产生，与昆虫体壁接触后，在24h 内Pr1的表达提高10倍左右，60h后由菌丝附近向周围扩散[14]。同时研究表明，Pr1的表达受碳氮抑制。在克隆的基因的启动子上有碳调控因子结合位点（5'>(g/c)YggRg<3'）和氮调控因子结合位点（相隔很近的DNA序列GATA），而且碳调控蛋白基因[15]和氮调控蛋白基因都已克隆[16]。

在金龟子绿僵菌Pr1类蛋白酶至少有4种同工酶[14]，连同已发表的[17]和基因[18]，从金龟子绿僵菌ME1菌株（即ARSEF2575菌株）克隆的Pr1同工酶基因还有、和等，在GenBank登录号分别为AJ251964、AJ293220和AJ416689。对这些Pr1类基因的氨基酸序列进行分析发现，它们的活性区域都一样，其它部分序列变化较大。

证明Pr1类蛋白酶在昆虫病原真菌致病寄主过程中起重要的直接证据是对基因的破坏和超量表达实验。基因被破坏的金龟子绿僵菌毒力有下降现象，由于在这个突变体中同时有Pr1a的同工酶Pr1b等和一个金属蛋白酶高水平表达，使得毒力下降不明显[19]。但是，高效表达的金龟子绿僵菌菌株的毒力明显提高，杀虫时间缩短了25%，作物损失减少了40%。同时证明基因是一个致病因子，在昆虫血淋巴中高浓度的Pr1a蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度表达，导致昆虫中毒死亡[20]。同时由于在血腔中高水平表达的Pr1降解了寄主的免疫蛋白和脱毒蛋白，降低了寄主的免疫能力，从而使击倒昆虫的时间缩短[21]。这就使得人们想将用

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