基于核壳色谱柱快速测定栀子中栀子苷和西红花苷—1含量

基于核壳色谱柱快速测定栀子中栀子苷和西红花苷—1含量
目的建立快速同时测定栀子药材中栀子苷和西红花苷-1含量的分析方法。

方法采用常规液相色谱仪系统，Agilent Poroshell 120 EC-C18核壳色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 ?m），流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱，检测波长时间程序为240 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min）。

采用液质联用技术对色谱图中的主要成分进行指认。

结果栀子苷和西红花苷-1分别在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g进样量范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）；仪器精密度、稳定性、重复性试验RSD均小于3%；平均加样回收率分别为99.89%和101.74%，RSD 均小于3%。

采用液质联用技术对色谱图中的8个主要成分进行了指认，包括3个环烯醚萜类成分和5个西红花酸类成分。

结论该方法简便、快速、准确、重复性好，可为建立高效的栀子药材质量评价标准提供依据。

Abstract：Objective To establish a rapid method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in Gardeniae Fructus. Methods A conventional liquid chromatography system was used. An Agilent Poroshell 120 EC-C18 column （100 mm × 4.6 mm，2.7 ?m）was used with the mixture of acetonitrile-0.2% formic acid solution as the mobile phase in gradient elution. Detection wavelength was as follow：240 nm （0–7 min），440 nm （7–14 min）. At the same time HPLC-MS/MS technology was used to identify the main components of the chromatogram. Results The calibration curves of geniposide and crocin-1 were in good linearity among the ranges of 0.2–6.0 ?g and 0.04–1.2 ?g，respectively （r=0.999 9）. For the precision test，stability test，repeatability test，the RSD were less than 3%. The average recoveries were 99.89% and 101.74%，respectively，and all the RSD were less than 3%. Eight major components were identified by HPLC-MS/MS technology，including three iridoids and five crocetin derivatives. Conclusion The developed method is simple，rapid，accurate and reproducible，which can provide a basis for quality evaluation of Gardeniae Fructus.
Keywords：Gardeniae Fructus；geniposide；crocin-1；rapid analysis
梔子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效。

研究表明，栀子中含量较高且具有较强药理活性的成分主要有2大类，即以栀子苷为代表
的环烯醚萜类和以西红花苷为代表的西红花酸类成分[1-2]。

栀子苷具有抗炎、利胆等作用[3]，西红花苷在抗炎、抗心肌缺血、抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血脂等方面具有显著的药理作用[4]。

在前期系列工作基础上[5-6]，为提高检验效率、降低成本，本研究引入新型的核壳色谱柱，基于常规HPLC系统，建立同时测定栀子中2种主要成分栀子苷和西红花苷-1的快速分析方法，对栀子道地产区的样品进行含量测定，同时采用液质联用技术对色谱图中的主要成分进行指认。

1 仪器与试药
Aglient1200型高效液相色谱仪（配备在线脱气四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器），岛津LCMS-8040三重四极杆质谱仪，MUS/1006型超声波清洗器（深圳现代超声实业有限公司），A&DER-180A型万分之一分析天平（日本A&D公司）。

栀子苷（批号110749-201316）、西红花苷-1（批号111588-201303）对照品，中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇为色谱纯，德国Merck公司；甲酸为分析纯，广州市化学试剂厂；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

6批栀子药材均来自道地产区江西，购自广州市采芝林药业有限公司，批号分别为160510、160702、160706、161001、161007、161103，经广州白云山明兴制药有限公司中心化验室陈文荣高级工程师鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.7 ?m，100 mm×4.6 mm），流动相为0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min，7%～30%B；7～14 min，30%～75%B），流速为1.0 mL/min，检测波长为240 nm（0～7 min）、440 nm（7～14 min），柱温为40 ℃，进样量为10 ?L。

2.2 质谱条件
正离子模式检测；雾化气和干燥气均为氮气；干燥气流速10 L/min；雾化气流速3 L/min；脱溶剂管温度为300 ℃，加热模块温度为400 ℃；毛细管电压3 kV；全扫描范围为m/z 100～1200；柱后分流，流动相进入质谱检测器的量为0.5 mL/min。

2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取适量栀子苷和西红花苷-1对照品，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成含栀子苷1.0 mg/mL和西红花苷-1 0.2 mg/mL的混合对照品溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备
取栀子样品干燥粉末（过40目筛）0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇（V/V）50 mL，密塞，摇匀，称定质量，超声处理（功率300 W，频率30 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇（V/V）补足减失的质量，摇匀，用0.45 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液，备用。

2.5 系统适用性试验
精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各10 ?L，分别注入色谱仪，记录色谱图，见图1。

结果理论塔板数按栀子苷和西红花苷-1计算均不低于3000，2种成分色谱峰与相邻峰之间分离度均大于1.5，对称因子在0.95～1.05范围内，样品中其他成分不干扰待测成分的测定。

A
B
注：A.对照品；B.供试品；3.栀子苷；4.西红花苷-1
图1 栀子中栀子苷和西红花苷-1 HPLC图
2.6 色谱峰的指认
吸取各供试品溶液1 ?L，记录质谱信号。

在HPLC-MS/MS分析过程中，通过分析ESI-MS/MS提供的化合物保留时间、分子量信息、质谱裂解碎片的种类等信息，并结合对照品比对以及文献数据[7-8]，对色谱图中波长240 nm和440 nm 处的8个主要成分进行结构鉴定，包括3个环烯醚萜类成分和5个西红花酸类成
分。

结果见表1。

2.7 线性关系考察
分别精密吸取“2.4”项下混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，依次注入液相色谱仪，测定色谱峰面积，以对照品浓度（?g/mL）为横坐标，色谱峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。

栀子苷：Y=11.714X+4.173（r=0.999 9），西红花苷-1：Y=30.757X+12.105（r=0.999 9）。

结果表明，栀子苷和西红花苷-1进样量分别在0.2～6.0 ?g和0.04～1.2 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验
取同一混合对照品溶液10 ?L，按上述色谱条件连续进样6次测定。

结果栀子苷和西红花苷-1峰面积RSD分别为0.8%、0.5%，表明仪器精密度良好。

2.9 稳定性试验
取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10 ?L进行分析，记录峰面积。

结果栀子苷和西红花苷-1的峰面积RSD分别为1.1%、2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.10 重复性试验
取同一批栀子样品6份，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，进樣10 ?L，以外标两点法计算栀子苷和西红花苷-1的含量，结果2种成分含量平均值分别为5.18%、0.68%，RSD分别为1.2%、1.7%，表明本方法重复性良好。

2.11 加样回收率试验
精密称取已知含量的栀子样品粉末6份，每份100 mg，精密称定，分别加入相当于样品中栀子苷和西红花苷-1含量的对照品溶液适量。

按“2.4”项下方法制备供试品溶液，进样10 ?L测定，计算栀子苷和西红花苷-1的回收率和RSD。

结果见表2。

2.12 样品含量测定
精密称取6批栀子样品粉末0.2 g，按“2.5”项下方法制备供试品溶液，进样10 ?L，每个溶液进样3次，计算各样品中栀子苷和西红花苷-1的含量。

结果见表3。

3 讨论
近年来，基于核壳技术的新型Agilent Poroshell 120色谱柱通过独特的填料结构，拥有较高的柱效性能，同时柱压较低，使其能在常规液相系统上实现快速高效分离。

针对栀子苷和西红花苷-1的同时定量分析，常规HPLC分析方法的时间达40 min[9-10]。

本研究运用该新型色谱柱，成功实现了在常规液相系统上14 min内快速分析栀子成分的目的，分析时间明显缩短，大幅改善液相色谱的分离度、灵敏度，节省化学试剂，提高工作通量，从而节约分析成本，使液相色谱的分离能力得到进一步延伸和扩展，可极大提高分析工作的质量和效率，应用前景广阔。

全波长（200～600 nm）扫描发现，栀子苷在波长240 nm处有最大吸收，而西红花苷-1在440 nm处呈最大吸收。

两类成分的最大吸收波长不同，同时结合文献及本研究中的HPLC-MS/MS图谱，环烯醚萜类成分先于西红花酸类成分，且两类成分互不干扰。

因此，采用常见的可变单波长检测器，通过设定时间程序改变检测波长，选取7 min为检测波长转换点，使检测波长由240 nm变为440 nm，实现了一张色谱图同时呈现栀子中环烯醚萜类和西红花酸类两大类主成分的目的，更加方便直观。

本研究基于新型表面多孔填料技术色谱柱，采用常规HPLC系统结合程序变波长法同时测定了栀子中栀子苷和西红花苷-1的含量，应用该方法测定了6批道地产区栀子样品中上述2种成分的含量。

同时还采用液质联用技术对色谱图中的8个主要峰进行了指认。

本研究建立的含量测定方法分析时间短、重复性好、精密度高、专属性强，且常规仪器即可满足，适用面更广。

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