【CN109852633A】一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910212588.X
(22)申请日 2019.03.20
(71)申请人 淮海工学院
地址 222000 江苏省连云港市海州区苍梧
路59号
申请人 江苏愚公生命科技有限公司
(72)发明人 龚雪梅　薛勇　罗志丹　胡艳红　
张慧铭　韩挺翰　张晨蕾　
(74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限
公司 32224
代理人 曹征贵
(51)Int.Cl.
C12N 15/75(2006.01)
C12N 15/56(2006.01)
C12N 9/22(2006.01)
C12Q 1/34(2006.01) (54)发明名称
一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆
菌非特异性核酸酶的方法
(57)摘要
本发明公开一种基于芽孢杆菌表达系统高
效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在
于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽
孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌非特异性核酸
酶的高效表达；本发明重组表达出的灵杆菌非特
异性核酸酶，比活力是目前商业化产品的3倍，本
发明选用的芽孢杆菌分泌表达系统，从根本上解
决了由其他表达系统自身特性所引入的内毒素
及糖基化修饰等影响酶活或限制其应用的缺陷，
高效的分泌型表达无需破碎细胞，纯化步骤更为
简便，可以线性放大，便于规模性生产，值得推
广。

权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图5页CN 109852633 A 2019.06.07
C N 109852633
A
权　利　要　求　书1/1页CN 109852633 A
1.一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌的非特异性核酸酶的高效表达，具体步骤如下：
步骤1：通过人工合成或者PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因；
步骤2：构建灵杆菌非特异性核酸酶的组成型表达质粒；
步骤3：构建灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株；
步骤4：灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达；
步骤5：灵杆菌非特异性核酸酶的纯化；
步骤6：灵杆菌非特异性核酸酶的活力检测。

2.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤1中采用PCR扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因：选取菌株Serratia marcescens SM6平板培养菌落作为PCR模板，以灵杆菌非特异性核酸酶基因的5’-端和3’-端互补序列作为PCR扩增引物，利用高保真DNA聚合酶进行扩增获取灵杆菌非特异性核酸酶基因的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤2表达质粒骨架为pNC，通过酶切连接或无缝克隆的方式在其中插入SMNE编码基因和多聚组氨酸标签。

4.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤3将步骤2中获取的质粒转入大肠杆菌感受态细胞内进行培养扩增，然后抽提质粒，通过点击转化法转入短短芽孢杆菌感受态细胞，活化培养后获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株。

5.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤4中灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达，利用LB培养基接种灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养液，在30℃摇床以200rpm摇动培养，获得灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达。

6.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤5中灵杆菌非特异性核酸酶的纯化，将灵杆菌非特异性核酸酶的重组表达菌株培养24h，接着离心收集上清液，针对上清液中含有的非特异性核酸酶可溶组分进行Ni亲和层析和阴离子交换层析纯化，获得高纯度灵杆菌非特异性核酸酶。

7.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：
所述步骤6以测活液为底物，并对步骤5中纯化获得的重组非特异性核酸内切酶进行梯度稀释进行测定，并计算比活。

2。