云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究

收稿日期:2017-10-15
基金项目:中国烟草总公司科技重大专项项目(中烟办[2016]259号);黑龙江省科技计划项目(HN201301)
第一作者:侯慧慧(1992-),女,硕士研究生,从事植物真菌病原学研究,E-mail :1049346253@
通信作者:吴元华(1963-),男,博士,教授,从事植物病毒学和生物农药研究,E-mail :wuyh09@ ;夏
博(1981-),男,博士,讲师,从事寄生性种子植物防控及其与寄主互作机制的研究,E-mail :xiabo0522@ 云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定
及其融合群研究
侯慧慧1,孙剑萍2,刘子仪3,王学坚3,何元胜4,吴元华1,夏博1(1.沈阳农业大学植物保护学院,沈阳110161;2.黑龙江省烟草公司牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江157011;
3.云南省烟草公司普洱市公司,云南普洱655000;
4.云南省烟草公司临沧市公司,云南临沧677000)
摘要:2016年云南省普洱市和临沧市烟草种植区大面积发生叶部病害,经鉴定为烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn),此病为云南烟区首次发现。

广泛采集2个市的烟草靶斑病病叶标本59份,采用常规组织分离法获得58个菌株,将所获菌株分别与立枯丝核菌标准融合群菌株AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9进行载玻片对峙培养,并进行菌丝融合观察,结果表明:58个菌株均属于立枯丝核菌AG-3标准融合群,且不与其他标准融合群发生融合反应。

随机选取云南省6个地区各1个代表性菌株,以待测菌株的基因组DNA 为模板,利用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4对病菌rDNA ITS 序列进行PCR 扩增,扩增产物序列在GenBank 中进行BLAST 同源性检索比对。

应用MEGA 6.06软件和Neighbor-Joining 法,分别计算遗传距离及构建系统发育进化树分析亲缘关系。

基于5.8S rDNA-ITS 区序列的系统发育树进一步分析,结果表明,Rhizoctonia solani 菌株的ITS 序列可明显的分为2个支系,同一菌株的不同ITS 序列可分别存在不同的分支中,但所有菌株的序列均隶属相同的融合群即AG-3,且隶属相同融合群的不同菌株之间其序列的一致性可高达99%~100%。

关键词:烟草靶斑病;云南;立枯丝核菌;融合群;5.8S rDNA-ITS 区序列分析
中图分类号:S432.1文献标识码:A 文章编号:1000-1700(2018)02-0203-06
Identification and Anastomosis Groups of Tobacco Target Spot Disease (Rhizoctonia solani Kühn)in Yunnan Tobacco Planting Areas
HOU Hui-hui 1,SUN Jian-ping 2,LIU Zi-yi 3,WANG Xue-jian 3,HE Yuan-sheng 4,WU Yuan-hua 1,XIA Bo 1
(1.College of Plant Protection,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China;2.Northeast Agricultural Test Station of CNTC,Mudanjiang Heilongjiang 157011,China;3.Yunnan Tobacco Company Puer City Company,Puer Yunnan 655000,China;
4.Yunnan Tobacco Company Lincang company,Lincang Yunnan 677000,China)Abstract :A kind of tobacco leaf disease occurred in a large area in Puer and Lincang of Yunnan Province in 2016,which was identified as tobacco target spot disease caused by Rhizoctonia solani Kühn,the first discovery in Yunnan tobacco planting areas.A total of 58isolates of R.solani were obtained from 59samples of tobacco leaf spot disease samples from Yunnan Province.Furthermore,they were respectively cultured on slide with R.solani standard strains,AG-1-IA,AG-2-1,AG-3,AG-4-HGⅡ,AG -5,AG -6GV,AG -8and AG -9.Observation for the mycelium fusion showed that all the 58isolates belonged to the anastomosis group 3(AG-3).Six representative strains from 58isolates were randomly selected,and the rDNA ITS sequences of the R.solani were amplified by PCR using the fungal ribosome gene transcribed spacer (ITS)universal primers ITS1and ITS4,and compared by nucleotide BLAST with other nucleotides in GenBank.The MEGA 6.06software and the Neighbor -Joining method were applied separately to calculate the genetic distance and construct phylogenetic tree for analyzing the genetic relationship.Phylogenetic tree analyzing based on the
5.8S rDNA -ITS region sequence showed that the ITS sequences of Rhizoctonia solani strains could be clearly divided into two branch lines,and different ITS sequences of the same strain could exist in different branches,and the sequence identity of different strains belonged to the same fusion group with similarity as 沈阳农业大学学报,2018,49穴2雪:203-208
Journal of Shenyang Agricultural University
侯慧慧,孙剑萍,刘子仪,等.云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究[J].沈阳农业大学学报,2018,49(2):203-208.http :// DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2018.02.011
第49卷
沈阳农业大学学报--烟草是云南省重要经济作物之一,其种植面积占全国烟草种植面积的40%以上,居我国首位,产量亦居全国第一。

烟草靶斑病是我国近年新发生的一种叶部病害[1],其病原为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),有性世代为瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris (Frank)Donk][2]。

此病最早在巴西发生,哥斯达黎加、美国、南非和津巴布韦也均有分布[3-4],严重时可造成80%以上的产量损失。

该病害在我国的辽宁、吉林、黑龙江、广西等省已陆续报道[5-6],但云南省此前尚未发现此病害。

2016年,云南省普洱市和临沧市许多烟草种植县区爆发流行叶部病害,面积达5333hm 2以上,严重地块发病率可达100%,造成直接烟叶经济损失巨大。

本课题组对该病病原进行
了分离鉴定,并利用菌丝融合群鉴定手段和5.8s rDNA-ITS 区序列分析方法,研究了云南省烟草靶斑病菌的融合群类群,为今后深入开展病原种群变异研究和有效控制该病的蔓延危害提供重要理论基础。

1材料与方法
1.1材料2016年,供试烟草(Nicotiana tabacum Linn.)标本采自云南省普洱市和临沧市2个市(州)的7个采集点,共得到59份样品,经分离纯化共得到58株菌株;立枯丝核菌标准菌株AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9,由沈阳农业大学植物保护学院病毒室保存。

供试ITS 引物、DNA marker 均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200g,琼脂粉17g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,高压灭菌。

1.2方法
1.2.1病原菌的分离2016年从云南省普洱市和临沧市的7个烟草种植县采集烟草靶斑病标本,采用常规组织分离法从新鲜病叶的病健交界处分离,于25℃,24~48h 恒温培养。

待菌丝长出,根据PARMETER 等的鉴定标准[7],镜检确认是立枯丝核菌后,切割单枝菌丝尖端,进行单菌丝分离与纯化,移植于PDA 斜面上培养,以获得该菌株的纯培养物,根据采集地点进行编号。

同时,刮取样品病斑处的子实体,进行形态观察。

1.2.2致病性测定采用柯赫氏(Koch)证病规则进行接种试验,用打孔器从PDA 平板培养基上培养3d 的菌落边缘打下5mm×5mm 菌饼,针刺经75%酒精表面消毒后的烟草品种Nc89和云烟87叶片,接种点用无菌水浸湿的脱脂棉保湿,上面用塑料薄膜覆盖,以空白的PDA 琼脂块接种叶片作为对照,每个处理10片烟草叶片,重复3次。

接种3d 后移除菌饼,并观察发病情况,于病斑处再次分离病菌,与接种菌进行形态比较与融合测定。

1.2.3菌丝融合群的鉴定与实验室标准测试菌株AG-1-IA、AG-2-1、AG-3、AG-4-HGⅡ、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9进行融合群测定。

采用玻片配对法,将待测菌分别与各融合群标准测试菌株配对进行融合观察[7-8]。

1.2.4菌丝基因组DNA 的提取随机选取6个不同地区编号为MZ-2、JG-5、SJ-8、SM-6、ZY-1和JD-2的菌株,28℃培养3d 后,取菌饼转移至盛有PD 培养液的培养皿中,28℃下静置培养,待菌丝长满皿后,取出菌丝,真空干燥后装入1.5mL 的离心管中,-20℃备用。

DNA 提取所用试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司,提取过程严格按照说明书操作。

1.2.5 5.8S rDNA ITS 序列扩增及分析采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1和ITS4对病菌rDNA ITS 序列进行PCR 扩增。

TS1为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3',ITS4为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR 扩增反应体系:10×PCR Buffer 2.5μL,MgCl 2(25mmol ·L -1)2.0μL,dNTP(2mmol ·L -1)0.5μL,ITS1(10μmol ·L -1)和ITS4(10μmol ·L -1)各1.0μL,模板DNA(50ng ·μL -1)1μL,Taq 酶(5U ·μL -1)0.5μL,加ddH 2O 至25μL,反应总体积为25μL。

扩增反应程序:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火35s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,采用GoldenView 染色,在凝胶成相系统观察并拍照。

将PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化并测序。

测序结果在GenBank 核酸序列数据库进行同源序列搜索及比对分析。

ITS 序列信息登录GenBank 注册。

将获得ITS 序列采用Clustal X 软件比对分析,并用merger6.06软99%-100%,which showed that all the strains belonged to the same fusion group of AG-3.This is the first report of tobacco target spot disease caused by Rhizoctonia solani (AG-3)in Yunnan Province,China.Key words :Tobacco target spot;Yunnan;Rhizoctonia solani Kühn;anastomosis group;5.8s rDNA-ITS sequence 204
侯慧慧等院云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究
第2期--件构选用Kimura-2-parameter距离模型,采用Neighbor-Joining构建系统树,以自展法(Bootstrap)检测各分支的可信度,重复1000次。

2结果与分析
2.1烟草靶斑病菌的分离与鉴定
从采自云南省普洱市和临沧市的50余份烟草靶斑病叶标本分离得到58个菌株(表1),其形态特征符合PARMETER等[7]对立枯丝核菌种的描述。

主要特征有:菌丝粗壮、有分隔,菌丝宽为6~11μm;菌丝分支在其起源处有缢缩,且距起源处不远有隔膜,隔膜具桶孔;直角或锐角分支,菌体呈深浅不同的褐色;菌丝细胞为多核(图1),据此鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),属无性类真菌,丝孢纲,无孢目,丝核菌属。

另外,从采集到的样品病斑处能观察到其有性世代,子实体呈扁平奶油色至灰白色,松散地贴在病斑上,担孢子球形至椭圆形(图2),应为瓜亡革菌[Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk],属于担子菌门,层菌纲、无隔担子菌亚纲,胶膜菌目,亡革菌属。

单个担孢子经分离培养后观察,其性状为立枯丝核菌。

表1立枯丝核菌的分离株及其来源
Table1Isolates of Rhizoctina solani and their sources
菌株号Strain No. MZ-01~07 JG-01~09 SM-01~13 ZY-01~03 JD-01~11 SJ-01~10 LX-01~05
来源
Source
云南普洱市宁洱县Ninger county in Puer city,Yunnan
云南普洱市景谷县Jinggu county in Puer city,Yunnan
云南普洱市思茅区Simao county in Puer city,Yunnan
云南普洱市镇沅县Zhenyuan county in Puer city,Yunnan
云南普洱市景东县Jingdong county in Puer city,Yunnan
云南临沧市双江县Shuangjiang county in Lincang city,Yunnan
云南临沧市临翔区Linxiang county in Lincang city,Yunnan
菌株数量
Number of strain
7
9
13
3
11
10
5
图1烟草靶斑病菌培养形态图(示菌丝)
Figure1Morphology of the pathogen of tobacco
target spot disease(Coenocytic mycelium)
图2病斑上观察到病菌的子实体(示担孢子)
Figure2Hymenium of the pathogen observed on
the lesions(Basidiospora)
2.2致病性测定
接种3d观察结果表明,2个烟草品种Nc89和云烟87叶片均表现出与大田相似的症状(图3),病斑初呈斑点状,然后逐渐扩展成圆形或椭圆形,周围有淡黄色晕圈,伴有同心轮纹,病斑中央易穿孔。

从发病部位经常规组织分离后再次得到病原菌,经过镜检和与原接种体菌丝融合测定,表明与原接种体为相同的病原菌(图3),因此证实了分离的原接种菌株为致病菌。

田间病症与接种后症状都与SHEW等[3]报道一致。

2.3立枯丝核菌菌丝融合群测定
采用载玻片定位融合法,将待测菌株与标准菌株对峙培养,对58个立枯丝核菌菌株进行融合群测定。

结果
205
第49卷沈阳农业大学学报--表明,采集自云南宁洱县、景谷县、思茅区、镇沅县、景东县、双江县和临翔区7个县区的烟草靶斑病菌菌株全部与AG-3标准融合群融合,即菌丝接触后,接触细胞间细胞壁溶解,细胞质相互融合,细胞核流入另一菌丝内(图3A);而不与其他标准融合群菌株如AG-1-IA、AG-2-1、AG-4-HGII、AG-5、AG-6GV、AG-8和AG-9融合(图
3B)。

A.菌丝间完全融合
A.The complete fusion of two mycelia
B.菌丝间不融合
B.The non-fusion of two mycelia 图3烟草靶斑病病菌的菌丝融合Figure 3Hyphal fusion reaction of Rhizoctonia solani isolates from tobacoo 2.4 5.8S rDNA-ITS 区序列扩增及分析
采用上海生工公司UNIQ-10柱式真菌基因组抽
提试剂盒,随机提取6个不同县区烟草靶斑病菌代表
菌株的基因组DNA。

利用通用引物ITS1和ITS4对烟
草靶斑病菌6个代表菌株进行扩增,将PCR 产物经
过1%琼脂凝胶电泳检测得到一条特异性条带,测序
结果表明,ITS 序列长度为660~680bp,与目的片段大
小基本一致。

将所测定的ITS 序列在GenBank 中注册,并获得登录号(表2)。

将测得的6个菌株的5.8S rDNA-ITS 区序列在NCBI 中进行BLAST(https:///)检索比对分析,结果显示,编号为MZ-2,JG-5,SJ-8、SM-6和JD-2的待测菌株,均与登录号为HQ241274.1的ITS 序列具有100%同源性,属于AG-3融合群;而编号为ZY-1与引起番茄叶部病害同属于AG-3融合群编号为GQ885147.1的ITS 序列具有99%同源性。

结合平板对峙培养结果分析,与此分子水平上鉴定的结果相一致,从而验证了平板对峙培养的准确性。

为进一步明确这些菌株的分类地位,根据BLAST 比对结果,得到与这些菌株亲缘关系最近的标准测试菌株序列。

利用CLUSTL X 软件对供试菌株及标准测试菌株的序列进行多重序列比较。

将测得的6个待测菌株和在Genbank 上挑选出的8个已知菌株[AG-3(HQ241274.1、KF234144和GQ885147.1)、FM867594.1(AG-4-HG Ⅱ)、LT576176.1(AG-1-IA)、KP662692.1(AG-2-1)、KP171637.1(AG-5)、JX989006.1(AG-6GV)、KP171647.1(AG-8)、KP171638.1(AG-9)的序列],共计14条经MEGA6.06软件采用Neighbor-joining 聚类分析方法构建系统发育树(图3)。

编号为MZ-2,JG-5,SJ-8、SM-6和JD-2的待测菌株,与GenBank 上编号为HQ241274.1的AG-3融合群的己测试菌株聚成一簇,确定以上待测菌株属于AG-3融合群;编号为ZY-1待测菌株,与GenBank 上另一编号为GQ885147.1的已测试菌株AG-3融合群聚成一簇,确定ZY-1也属于AG-3融合群,且所有待测菌株与其他标准融合群菌株均不聚成一簇(图3)。

上述结果表明,隶属于不同融合群菌株的5.8S rDNA-ITS 区序列存在较大的差异,可以利用此基因序列对丝核菌不同融合群的菌株进行有效区分和鉴定。

表26个测序菌株的融合群归属及其登录号Table 2Anastomosis group and their GenBank No.of the six isolates used for sequencing 菌株Isolate MZ-2JG-5SM-6ZY-1JD-2SJ-8融合群Anastomosis group AG-3AG-3AG-3AG-3AG-3AG-3登录号Genbank accession numbers MG600241MG600242MG600243MG600244MG600245MG600246206
侯慧慧等院云南烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kühn)病原鉴定及其融合群研究第2期--
2.5烟草靶斑病菌不同融合群菌株的系统发育关系分析
由图3可以看出,依据本研究测得的6个代表菌株及8个源自GenBank 且隶属不同融合群的菌株所构建的系统发育树可以进一步发现,所有待测菌株被划分为2个支系,第1个分支由隶属于6个不同融合群(AG-3,AG-2-1,AG-9,AG-5,AG-1-IA 和AG-4-HGII)的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani )构成,该分支又可以进一步分为2个亚分支及多个亚亚分支,来自云南宁洱、景谷、双江、思茅和景东地区的待测菌株与编号为HQ241274.1可引起烟草叶部病害的AG-3融合群聚为一支,来自云南镇沅地区的待测菌株与编号为GQ885147.1可引起番茄和马铃薯病害的AG-3融合群聚为另一支,2个分支共同占据一支系,均为AG-3融合群。

所有待测菌株均不与AG-2-1,AG-9,AG-5,AG-1-IA 和AG-4-HGII 聚为一分支,说明在亲缘关系上相对较远。

第2个分支由隶属于AG-8和AG-6两个不同融合群构成,说明待测菌株与AG-8、AG-6两个融合群进化关系很远。

上述结果表明,引起云南省烟草靶斑病的病原菌均属于AG-3融合群。

3讨论与结论
由于样品来源和采集地的不同,烟草靶斑病病原菌的融合群构成存在一定的差距。

SHEW [3]等报道在美国北卡罗来纳州该病菌属于AG-2-2融合群;LAMONDIA 等[9-10]从美国马萨诸塞州、康乃迪克州罹病的烟草靶斑病植株分离获得的病菌菌株均为AG-3融合群;MEYER 等[4]报道南非的烟草靶斑病菌属于AG-3融合群;REELEDER 等[11]经鉴定引起加拿大烟草靶斑病的病原菌为AG-3融合群;MERCADO 等[12]首次报道阿根廷西北部地区烟草靶斑病菌属于AG-2-1融合群。

GONZALEZ 等[13]研究表明立枯丝核菌AG-2-2可引起烟草茎部病害,而AG-3可以导致烟草叶部病害靶斑病。

相对国外的研究,国内关于烟草靶斑病菌的报道较少。

吴元华等[14]报道了我国辽宁省丹东市和铁岭市烟草靶斑病原菌病菌也属于AG-3融合群;苏燕妮等[5]认为引起我国吉林省和黑龙江省烟区大面积发生的烟草靶斑病,与辽宁省已报道的烟草靶斑病菌都属于同一个融合群,即立枯丝核菌AG-3融合群;陈媛媛等[6]对广西烟草靶斑病菌的研究结果,首次从国内烟草靶斑病组织上分离到AG-2和AG-4融合群。

图4NJ 法构建6个供试菌株依据ITS 区序列的系统发育树Figure 4Neighbor-Joining phylogenetic tree constructed by analysis of 5.8S rDNA internal transcribed spacer nucleotide sequences from six isolates of Rhizoctonia solani
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沈阳农业大学学报
第49卷--
综上所述,虽然不同地域报道的烟草靶斑病菌的融合群类群有所不同,但都以AG-3为主要融合群类群。

本研究从采自云南省普洱和临沧地区的烟草靶斑病病斑上分离得到58株立枯丝核菌菌株,经融合群对峙培养测定,基本可以明确在我国云南省2个地区引起烟草靶斑病的立枯丝核菌均是AG-3融合群;应用分子生物学技术对烟草靶斑病菌的核糖体DNA中的内转录间隔区5.8s rDNA-ITS序列进行分析,同时将待测菌株序列与GenBank中的序列进行同源性比对,并构建系统发育树,表明云南省的烟草靶斑病菌各菌株与标准测试菌株AG-3融合群同源性达99%~100%。

本课题组首次系统研究了我国云南省烟草靶斑病菌菌丝融合群的归属问题,并对病菌的ITS序列进行了测定分析,对云南省烟草靶斑病的流行预警及病害防治提供了重要理论支撑。

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[责任编辑马迎杰]。