酸枣多糖抗衰老作用的实验研究论文

酸枣多糖抗衰老作用的实验研究
1 引言
1.1 酸枣简介
酸枣[Zizyphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu]又名棘刺、山枣、红珠、檀酸枣、红铃果，属鼠李科落叶灌木或乔木的成熟果实。

酸枣色形似枣，其味甘酸，故名[1]。

酸枣广泛分布于我国中、北部地区，无论林间地头、石缝崖边、向阳山坡、溪边草丛都适宜它的生长，有很强的适应性，抗逆性强，御寒抗旱、耐盐碱等。

酸枣树高1~3m，枝节上有直的和弯曲的刺。

叶互生，长椭圆形至蔟状披针形，长2~3.5cm，宽6~12mm，先端钝，边缘有细锯齿，基出三脉。

花黄绿色，常2~3朵簇生于叶腋。

花萼、花瓣及雄蕊均为5出数。

子房上位，2室，埋于花盘中，柱头2裂。

核果小，长圆形或近圆形，暗红色，味酸，果核两端常为钝头。

花期4~5月，果期9月。

酸枣树春季气温13℃~15℃萌动抽枝，17℃以上展叶和花芽分化，19℃以上叶腋出现花蕾，20℃~22℃开花，18℃~22℃果实成熟，10月下旬气温降到15℃开始落叶[2]。

1.2 酸枣的化学成分的研究
1.2.1 酸枣仁化学成分
对酸枣仁的化学成分在80年代就开始进行了研究，得知酸枣仁含有当药素、白桦脂酸、白桦脂醇、酸枣仁皂甙及阿魏酸、维生素C等成分[3]。

90年代后期，尤其是近10年来，对酸枣仁的化学成分研究又取得了较大的突破。

在酸枣仁的乙醇提取物中，用氢氧化钾和正丁醇处理，分得总黄酮及总皂甙两部分。

对总黄酮进行聚酰胺柱层析，从25%乙醇洗脱液中分得两种黄酮甙，经化学法和光谱法鉴定为Spinosin和Zivulgarin[4]。

尹升镇等人从酸枣仁中提取分离得到2种生物碱，经理化常数及紫外线（UV），红外线（IR），核磁共振(IHNMR)和MS波谱分析鉴定为
Lysicamin和Juzirine，均为首次从该属植物中获得[5]。

用离子色谱法简单快速地分析了酸枣仁中的阳离子。

分析结果表明，酸枣仁中5种常见阳离子Na+、NH+4、K+、Mg2+和Ca2+的含量比例不同。

各离子的检出限为0.001~0.013mg/L，线性范围达3个数量级[6]。

对酸枣仁采用原子吸收分光光度法等进行了微量元素的测定，并用氨基酸自动分析仪对游离氨基酸进行了测定。

结果表明，不同产地酸枣仁中均含有Fe、Mn、Zn、Se等7种人体必需的微量元素及酪氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、苏氨酸等8种人体必需氨基酸[7]。

酸枣仁中这些新化合物及元素的发现为进一步澄清酸枣仁的治疗作用机理奠定了理论基础。

在新化合物发现的同时，运用新方法和新技术对已知的化合物的分离、鉴定、含量测定也作了大量的研究工作，如从酸枣仁的乙醇提取物中，用KOH和正丁醇处理，分得总皂甙、总黄酮、总酚性成分三部分。

对酚性成分进行硅胶H干柱层析，以苯-氯仿-冰醋酸为展开剂分得一结晶，经化学法和光谱法及与对照品对照鉴定为阿魏酸[8]。

用薄层扫描法测定酸枣仁中酸枣仁皂甙A和B含量，其薄层展开剂选用正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5，上层)；2%香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂。

扫描条件：单波长反射法锯齿扫描，λs=632nm，SX=3，slit=1.25mm。

测定结果，不同产地的酸枣仁中，酸枣仁皂甙A 和B的含量相差悬殊。

对于同一样品中酸枣仁皂甙A的含量明显大于酸枣仁皂甙B的含量[9]，对不同产地的酸枣仁的种皮、胚乳和子叶中酸枣仁皂甙A和B的含量进行了测定，结果表明，皂甙A和B主要存在于子叶中，种皮和胚乳中含量甚微。

子叶被种皮和胚乳包裹住，“用时捣碎”可破碎种皮和胚乳，使子叶暴露出来，这有利皂甙A和B的充分提取和利用[10]。

应用分光光度法，经硫酸-苯酚显色，于490nm处测定吸收度，测定了酸枣仁中多糖的含量。

同一产地不同年份采集的3份样品含量分别为0.7185%，0.7519%和0.7856%[11]。

还有很多学者运用上述的方法和技术，对不同产地的酸枣仁的成分进行了研究，也取得了实质性进展。

1.2.2 酸枣果肉化学成分
回瑞华等报道了用蒸馏-萃取法提取酸枣果肉中挥发性物质，测得酸枣果肉挥发油的含量为1.80%，用GC/MS法从酸枣果肉挥发油中分离并确定出43种化学成分。

用峰面积归一化法通过化学工作站数据处理系统，得出各化学成分在挥发油中的相对百分含量。

其中主要成分为
酸类化合物占挥发油总量的52.26%，酚类化合物为9.34%，酯类化合物为23.05%，醛类化合物为2.77%，醚类化合物为2.66%，烷烃化合物为1.89%，其它类化合物仅占 3.77%。

共占酸枣果肉中挥发油总量的95.62%[12]。

用蒸馏-萃取法方法提取的酸枣果肉中挥发油中，鉴定出28种化合物，占挥发油总量的94.88%，其主要成分为：酸类化合物(15种)占挥发油总量的55.90%，酯类化合物(2种)占10.84%，醛类化合物(7种)占10.58%，醇类化合物(3种)占17.15%，酮类化合物(1种)仅占0.41%[13]。

实验采用普通的水蒸气蒸馏-溶剂萃取法和同时蒸馏-萃取法提取了挥发油，收率分别为1.80%和2.30%，收率的高低与实验条件和操作方法有关。

同时蒸馏-萃取法提取酸枣果肉的挥发油比普通水蒸气蒸馏-溶剂萃取法提取的酸枣果肉的挥发油收率提高了20%，但是化合物组分却减少了很多，这可能是由于同时蒸馏-萃取法温度、压力较高使一些化合物分解造成的。

1.3 酸枣的药理研究
1.3.1酸枣仁的药理研究
酸枣仁是一味常用的中药，为《中国药典》收载品种。

酸枣仁功效在《神农本草经》以及《本草纲目》中都有介绍，其味甘、微酸，性平。

归心、肝、胆经。

质润敛降，养心安神。

用于心肝血虚引起的心烦不安、心悸怔忡、失眠、益阴敛汗。

可治疗自汗、盗汗。

味酸收敛，甘酸化阴，主入心肝，善于补肝宁心，定神除烦，兼可敛汗生津。

适于肝血不足、虚烦不眠及体虚多汗、津伤口渴之证。

在对心血管系统的作用方面，张玮[14]研究中发现，酸枣仁总皂苷对正常组大鼠血液流变学指标无影响，但大、中剂量酸枣仁总皂苷可显著降低血瘀大鼠的全血黏度、血浆黏度，减少纤维蛋白原含量，体外血栓长度、湿重指数，提示酸枣仁总皂苷对血瘀大鼠的黏、凝有良好的改善作用，具有去纤、降黏、抗栓作用；张典等[15]指出，不同剂量的酸枣仁总皂苷对自发性高血压大鼠(SHR)血压有明显的降低作用，且在给药后0.5h即有表现，给药后7.5h药效消失，但是与阳性药相比起效缓慢；刘琼等[16]报告，酸枣仁油对实验家兔有明显的调脂作用，能降低甘油三酯
(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)，升高高密度脂蛋白(HDL)，可有效的预防动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生。

对中枢神经系统的作用方面，符敬伟[17]报道，酸枣仁总生物碱25-100mg/kg给小鼠灌胃可减少小鼠自发活动，表明酸枣仁总生物碱具有明显的镇静作用，能显著延长阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠时间，增加阈下剂量戊巴比妥钠睡眠动物数和睡眠时间，表明酸枣仁总生物碱与戊巴比妥钠有协同作用，并能对抗士的宁引起的小鼠惊厥，提示酸枣仁生物碱可能是酸枣仁中枢抑制作用的有效成分。

段瑞等[18]报道，酸枣仁能抑制过度亢进和异常的神经细胞，使长期处于紧张或紊乱状态下的皮质细胞获得充分休息和调节，使兴奋和抑制过程恢复平衡，表明酸枣仁汤可促进正常小鼠的学习记忆，改善由东莨菪碱所致的记忆获得障碍及由乙醇造成的记忆再现障碍。

进一步研究[19]表明，酸枣仁汤的镇静、催眠、抗焦虑作用，可能是通过提高焦虑大鼠脑组织γ-氨基丁酸GABAA 受体mRNA表达水平，增加脑组织GABAA受体量来提高了GABAA 的功能，从而发挥了作用。

酸枣仁能抑制中枢神经系统，有较恒定的镇静作用。

对于血虚所引起的心烦不眠或心悸不安有良效，故酸枣仁可以做汤做蒸甜饭，通过食用即可安神养心治疗失眠，从而达到药食两用的效果。

1.3.2酸枣果肉的营养及生物活性研究
酸枣的果肉含有多种营养成分，含大量维生素C和多种氨基酸，有9种人体必须氨基酸，含有葡萄糖，半乳糖和甘露糖等多糖成分，测得31种微量元素等[20]。

酸枣肉的水醇提取液可对抗浓氨水引起的小鼠致咳作用，与对照组比减少咳嗽次数66.62%；水醇提取物可抑制电刺激小白鼠引起的激怒反应，与对照组比可减少66.67%；也能对抗安钠咖所致的小白鼠惊厥作用，可延长惊厥发生时间，与对照组比可延长85.06%，并延长小鼠存活时间29.25%。

酸枣肉水煎剂给小鼠饮用，可延长小鼠游泳时间，与对照组比延长34.62%，表明它有增强肌力作用。

该研究进一步表明酸枣肉对中枢神经系统的影响是多方面的。

推测其抗小鼠激怒作用除其明显的镇静作用外，还可能有一定程度的安定作用；它能对抗药物所致惊厥，而不能对抗最大电休克所致惊厥，这可能有一定程度的对抗癫痫小发作作用[21]；它对抗氨水的致咳作用类似大枣树皮乙醇提取物的作用，对慢性气管炎的治疗可能有益，酸枣肉水煎剂能延
长小白鼠游泳时间，这种增强肌力的作用与大枣煎剂相似，有利于增强体质。

其作用机理有待于进一步研究。

1.4 多糖的药理作用及研究现状
1.4.1动物多糖的药理作用[22]
随着多糖研究的进一步发展和对动物药材的日益重视，对动物多糖的研究也逐渐增多。

动物多糖主要有糖原、甲壳素、肝素、硫酸软骨素以及透明质酸等。

1.4.1.1抗癌，提高免疫力
多糖抗癌的原因大多是激活体内免疫系统，提高机体免疫力。

据报道，文蛤多糖、鲍鱼多糖、鹿茸多糖等均有此作用。

1.4.1.2抗凝血、抗血栓作用
肝素、低分子肝素等小分子多糖能够抑制凝血蛋白酶原转变成凝血酶，具有抗凝作用，目前已广泛用于实验研究与临床中。

其它一些酸性粘多糖，主要存在于海洋生物，也具有抗凝作用。

刺参酸性粘多糖能够抑制纤维蛋白单体的聚集，机理是提高纤溶酶活性，改变凝胶结构，促进纤溶过程。

玉足海参中提取的酸性粘多糖已研制成胶囊，具有抗凝和降低血粘的功效。

1.4.1.3降血脂
鲨鱼软骨酸性多糖能使腹腔注射卵黄乳液而造成的高血脂症的小鼠血清胆固醇和甘油三酯含量降低，而对正常小鼠无影响。

甲壳胺也具有一定的降血脂作用。

1.4.1.4对心率的影响
壳多糖对豚鼠单一心室肌细胞的外向K+电流具有抑制作用，并与壳多糖浓度有相关性。

其衍生物羧甲基甲壳胺对其Ca2+内流具有抑制作用，使电流量减少，并有明显的电压依赖性、浓度依赖性和可恢复性，使心肌自率性降低，延长心肌细胞的动作电位时程和有效不应期，从而发挥抗心率失常的作用。

1.4.1.5 保护内皮细胞，防止细胞增殖
壳多糖对氧自由基导入脐静脉内皮细胞损伤具有一定保护作用，可能由于其在内皮细胞膜表面形成一层糖屏障，保护了膜结构的完整性，
从而防止受到氧离子自由基的损伤，也可能抑制氧自由基的产生。

1.4.1.6 其他作用
肝素具有抗炎作用，能够减轻小鼠实验性耳水肿、大鼠足肿胀及大鼠松节油气囊肉牙肿。

几种氨基多糖可以促进巨核祖细胞造血功能。

透明质酸对小鼠卵细胞的发育及受精有促进作用，对排卵前卵细胞的间隙扩大及卵细胞的成熟至关重要，最佳受精能力的出现与透明质酸基质合成及潴留浓度密切相关。

1.4.2 菌多糖的药理作用
菌多糖的药理作用主要为抗肿瘤作用：实验证明猪苓多糖能显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活力是一种良好的免疫调节剂，如佐以化疗药物治疗原发性肺癌对鳞癌的有效率最佳为80%。

猪苓多糖对小鼠腹水性肝癌抑瘤率为39%。

中国医学科学院肿瘤研究所对猪苓多糖与抗癌药物的合并应用，抗肿瘤转移作用，放疗增敏及病理状态下机体免疫功能的调节作用进行了实验，结论是：猪苓多糖在肿瘤合并治疗中的地位不容忽视，对机体细胞免疫功能的调节应予肯定。

老山云芝蛋白多糖系从云芝菌丝体中提取分离得到，可抑制小鼠肿瘤生长，有延长肝癌小鼠生存期的作用。

其制剂对肝癌患者自觉症状的改善，恢复肝功，增强机体免疫方面有较明显效果。

此外，根据多种临床实验报告，香菇多糖对肿瘤、肝炎、高胆固醇血症、心脏病及神经衰弱均有一定疗效。

灵芝多糖也是灵芝扶正固本的有效成分。

实验表明，银耳多糖除抗肿瘤作用外，还具广泛的药理作用，如抗衰老、抗放射、促进蛋白质及核酸的合成、抗溃疡作用、保肝作用、抗突变作用、抗血栓作用、延长凝血时间、降血糖血脂、抗炎等作用。

1.4.3 植物多糖的药理作用
1.4.3.1抗病毒作用
研究发现红藻中提取的红藻多糖在细胞水平上能明显抑制牛免疫缺陷病毒BIV的生长，具有开发AIDS药物的前景。

经证实：红藻多糖是多糖的衍生物硫酸化多糖。

徐天雄等[22]报道云芝糖肽具有明显的抗乙型肝炎病毒作用。

复制型慢性乙肝患者口服云芝糖肽胶囊，HBeAg阴转率为40.0%，抗-HBcIgM阴转率为46.7%，HBV-DNA阴转率为33.3%。

1.4.3.2抗辐射作用
猪苓多糖对受辐射损伤的大鼠造血功能及免疫功能的影响。

结果表
明，腹腔注射猪苓多糖后，对大鼠的造血功能和免疫功能抑制具有逆转的作用。

并且使因受辐射损伤的大鼠有核细胞数、脾指数及NK细胞活性有明显提高。

瓦茸多糖对受照射小鼠脾脏损伤的恢复作用。

小鼠受照后，其脾脏重量及脾脏细胞的DNA合成速率下降，而瓦茸多糖对因辐射所导致的脾脏损伤有显著的修复作用，并可提早恢复辐射对脾脏功能的抑制作用。

梁永能等[23]采用60Cor射线7.5Gy对NIH小鼠进行一次性全身照射，结果表明，云芝提取液对60Cor射线照射的小鼠有显著的保护作用。

八十年代日本科学家已成功地在云芝提取液中找到它的有效成分为一种含蛋白质及多糖的物质。

1.4.3.3延缓衰老
中医延缓衰老的保健药方多为补益类中药方剂，这些植物药中含量较高的成分为多糖类。

魔芋为天南星科多年生草本植物，实验用绞股蓝总苷作衰老对照，结果魔芋多糖的给药剂量仅为其四分之一，即可达到与之相当的效果。

魔芋多糖抗衰老作用与清除体内自由基有关。

研究发现，肉苁蓉多糖能延缓皮肤衰老，增加动物羟脯氨酸的含量，胶原纤维含量增加，皮肤弹性增加，降低体内脂褐质的堆积。

淫洋藿多糖可使被抑制的T细胞、B细胞功能明显恢复，说明其可以延缓衰老的生化代谢障碍及免疫低下。

另外，何首乌、人参、黄芪、女贞子的多糖都有一定的抗衰老作用，对机体多种生理，生化功能的促进与调节作用较为全面。

1.4.3.4 抗肿瘤
将多糖作为抗肿瘤药物，可以克服肿瘤病人化疗和放疗过程中在杀死肿瘤细胞的同时造成的对正常细胞的损伤。

极大螺旋藻胞内多糖对体外生长的U937细胞有促进生长的作用，而对体外生长的HL-60细胞有抑制生长的作用。

提示极大螺旋藻胞内多糖对人的血癌细胞的生长有明显的影响。

徐琳本等[24]按常规接种肿瘤法，将瘤株接种到每只小鼠，然后给予羧甲基茯苓多糖口服液，连续给药一定时间后测瘤重，结果有显著的抑瘤作用，对S180瘤株最高抑制率达64.18%，对EAC瘤株的抑制作用亦非常明显。

另外还使荷瘤小鼠的肿瘤坏死因子含量明显提高。

徐中平等[26]给小鼠皮下接种RIF-1肿瘤细胞，昆布多糖硫酸酯(LAMS)单独给药，肿瘤生长延迟2.6天，LAMS与四氢皮质甾醇合用，使RIF-1肿瘤生长延迟4.8天，苯丙氨酸氮芥与LAMS联用，可使RIF-1肿瘤生长延迟6.1天，而单独应用苯丙氨酸氮芥仅能使RIF-1肿瘤生长延迟2.2
天。

1.4.3.5 免疫调节作用
现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，使人们认识到免疫系统的紊乱不仅会产生多种疾病，而且与人体衰老及老年人多发病有关。

艾滋病的危害，使人们对免疫缺损的严重后果有了更深刻的认识。

科学家们发现，植物多糖最重要的药理作用为免疫促进作用。

牛膝多糖具有显著的增强机体免疫功能作用。

它能升高血清溶血数和脾脏内抗体形成细胞数，提高血清免疫球蛋白IgG水平，能激活网状内皮系统的吞噬功能，激活巨噬细胞促进TNF和IL-2的生长，促进淋巴细胞的增殖，增强NK细胞和CTL细胞的活性。

川芎多糖能非常显著地拮抗Cy所致的体液免疫抑制，使其恢复正常。

另外，川芎多糖能显著或非常显著的增加正常或Cy组小鼠的脾脏和胸腺的重量，说明川芎能提高机体非特异免疫功能。

黄芪多糖可显著提高小鼠抗体形成细胞的数量，体外培养C57BL小鼠，测定其对刀豆素A和细菌脂多糖的反应，结果显示，黄芪多糖存在时，脾细胞对刀豆素A的反应下降，而对细菌脂多糖的反应则升高，提示黄芪多糖在体外有抑制T细胞的反应，促进B细胞的作用。

另外还能纠正环磷酰胺对抗体形成细胞的抑制作用。

近年来关于多糖的研究越来越深入而广泛，已有多种多糖物质被研发为临床制剂或保健食品，如香菇多糖、云芝多糖、牛膝多糖等。

酸枣为北方地区分布广泛的野生或栽培树种，酸枣仁已是一味常用的中药，为《中国药典》收载品种。

酸枣果肉的利用尚有待开发，故本文以酸枣果肉为原材料对多糖的生物活性做了以下研究。

2 材料与方法
2.1 实验动物
小白鼠：昆明种，体重20g~25g，购于河北医科大学动物室，动物许可证号：SCXK（冀）2003-1-3，动物合格证号：803156。

2.2 试剂与仪器
2.2.1主要试剂
超氧化物歧化酶（SOD）测试盒[羟胺法，测总SOD]，丙二醛（MDA）测试盒[TBA法]，过氧化氢（CAT）测试盒[钼酸铵法（可见分光光度法）]均购于南京建成生物工程研究所；D-半乳糖购于国药集团化学试剂有限公司，维生素E胶丸为浙江医药股份有限公司生产。

2.2.2主要仪器
旋转蒸发器（型号RE52-99，上海亚荣生化仪器厂）
恒温水浴锅（型号HH-4，金坛市科兴仪器厂）
低速大容量离心机（型号LD4-40，北京医用离心机厂）
超级恒温水浴（型号HH-501，金坛市科兴仪器厂）
低速离心机（型号LD4-2，北京医用离心机厂）
循环水多用真空泵（型号SHZ-3，上海沪西分析仪器厂）
分光光度计（型号722，厦门分析仪器厂）
真空干燥箱（型号DZF-1，上海跃进医疗器械厂）
冷冻干燥机（型号FD-1，北京博医康技术公司）
高速冷冻离心机（型号TGL-16G-A，上海安亭科学仪器厂）
台式离心机（型号TDL80-2B，上海安亭科学仪器厂）
紫外可见分光光度计（型号WFZ UV-2000，尤尼柯仪器有限公司）分析电子天平（型号FA2004，上海天平仪器厂）
2.3 实验方法
2.3.1 酸枣多糖的制备
新鲜酸枣洗净擦干，称重后将其放入通风干燥箱内105℃烘2h以灭其活酶活性，再将温度调至75℃烘干至恒重，24h后取出酸枣将其果肉进行粉碎。

取一定量的酸枣果肉粉末放入索式提取器中，圆底烧瓶中加入250mL甲醇-乙酸乙酯混合液（按4:1混合）在80℃恒温水浴锅中回流抽提，直至抽提液的颜色呈微黄。

晾干后取500g的酸枣放入烧杯中，加入600mL蒸馏水，调节pH值呈弱碱性浸泡10h，然后放入90℃恒温
水浴锅中2h至3h浸提，将浸提液加入离心管4000r/min离心20min，取上清液用双层滤纸抽滤得粗糖液。

向以上所得糖液中加入木瓜蛋白酶（称取80万U/g的木瓜蛋白酶0.05g稀释至133mL得300U/g的酶液）37℃水浴加热1h进行脱蛋白，再加入活性炭（在180℃干燥箱中活化3h）进行脱色，然后双层滤纸抽滤，向所得糖液中加入四倍体积乙醇使多糖沉淀，4000r/min离心10min 得多糖，真空干燥箱75℃干燥24h。

将以上所得多糖冷冻保存。

2.3.2 动物分组与处理
2.3.2.1动物分组与灌药剂量
取体重20~25g雄性小鼠50只，随机均匀分为5组，每组10只重复。

连续灌药30天，同时其中四组颈背部皮下注射D-半乳糖造糖代谢衰老模型，另一组注射同等剂量的生理盐水，每3天称体重1次，根据体重调整D-半乳糖和相应药物用量。

灌药组别与剂量如下：Ⅰ空白对照组（灌服0.5mL蒸馏水）
Ⅱ模型对照组（灌服0.5mL蒸馏水）
Ⅲ阳性对照组（灌服0.5mL维生素E溶液，30mg/kg体重）
Ⅳ小剂量组（灌服0.5mL酸枣多糖液，250mg/kg体重）
Ⅴ大剂量组（灌服0.5mL酸枣多糖液，500mg/kg体重）
2.3.2.2造糖代谢衰老模型
称取1.9525gD-半乳糖加入25mL生理盐水配制成7.81%的D-半乳糖溶液，灌药组中除空白组外其余4组每天颈背部皮下注射D-半乳糖（注射量为0.4mL/25g体重）造糖代谢衰老模型，连续注射D-半乳糖30天。

2.3.3血及组织MDA的测定方法
2.3.3.1血及组织样采集与处理步骤
乙醚麻醉小鼠，用硅化过的毛细管由小鼠眼眶内眦插入取血，在取血过程中慢慢的旋转毛细管加快出血速度，将血流入加有20μL肝素（5000单位/mL）的1.5mL的离心管中，轻轻摇动离心管，15000r/min 离心15min，用移液器取0.1mL上清液作为测定MDA的样品。

2.3.3.2 血及组织样MDA的测定步骤
MDA试剂盒组成与配制
试剂一：液体20mL×1瓶，室温保存。

试剂二：液体12mL×1瓶，每瓶加340mL 双蒸水混匀，4℃冷藏。

试剂三：粉剂×1支，用时将粉剂加入到90℃~100℃的热蒸馏水60mL （在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至60mL 再加冰醋酸60mL ，混匀，配好的试剂避光冷藏。

标准品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷5mL×1瓶 按照试剂盒说明书方法测MDA 含量，步骤如下：
——
标准管 标准空白管
测定管 测定空白管
10nmol/mL 标准品(mL)
0.1 —— —— —— 无水乙醇(mL) —— 0.1 —— —— 血浆(mL) —— —— 0.1 0.1 试剂一(mL)
0.1
0.1
0.1
0.1
混匀(摇动几下试管架)
试剂二(mL) 3 3 3 3 试剂三(mL) 1 1 1 —— 50%冰醋酸(mL)
——
——
——
1
旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一个小孔，95℃水浴(或用锅开盖煮沸)40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟，取上清液6000转/分再离心20min ，用移液器吸取上清加入比色皿中，532nm 处，1cm 光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

根据公式：
血浆中MDA 含量(nmol/mL)=
标准空白管吸光度
标准管吸光度测定空白管吸光度
测定管吸光度--×标准品
浓度(10nmol/mL)×样本测试前稀释倍数
计算MDA 含量。

2.3.4 血及组织CAT 的测定方法
2.3.4.1 血及组织样的采集与处理步骤
乙醚麻醉小鼠，用硅化过的毛细管由小鼠眼眶内眦插入取血，在取血过程中慢慢的旋转毛细管加快出血速度，将血流入加入20μL 肝素（5000单位/mL ）的1.5mL 的离心管中，轻轻摇动离心管，15000r/min
离心15min ，用移液器取0.1mL 上清液作为测定CAT 的样品。

2.3.4.2 血及组织CAT 的测定步骤
CAT 试剂盒的组成与配制
试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：底物液体10mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：显色粉剂一瓶，临用前加蒸馏水至100mL 溶解，4℃保存。

试剂四：液体10mL×1瓶，4℃保存。

用前热水浴至制试剂透明方可使用。

按照试剂盒说明书方法测定过氧化氢酶活力，步骤如下：
—— 对照管 测试管 血浆(mL) —— 0.1 试剂一(37℃预温)(mL) 1.0 1.0 试剂二(37℃预温)(mL)
0.1
0.1
混匀，37℃准确反应1分钟(60秒)
试剂三(mL) 1.0 1.0 试剂四(mL) 0.1 0.1 血浆(mL)
0.1
—— 混匀，0.5cm 光径，405nm 处，蒸馏水调零，测各管吸光度. 根据公式：血清中CAT 活力(U/mL) = (对照管OD 值-测定管OD 值)×271*×
取样量
601
×测前稀释倍数(U/mL)
注：*271为斜率的倒数 计算CAT 的活力。

2.3.5 血及组织SOD 的测定方法 2.3.5.1 血样采取及处理步骤
乙醚麻醉小鼠，用硅化过的毛细管由小鼠眼眶内眦插入取血，在取血过程中慢慢的旋转毛细管加快出血速度，使血流至涂过硅油的玻璃板上，用移液器取小鼠血50μL ，加预冷双蒸水0.25mL ，充分溶血后加预冷无水乙醇0.1mL ，振摇，再加预冷氯仿0.1mL ，混合器上抽提2min ，15000r/min 离心15min 得抽提液[26]。

2.3.5.2 血样SOD 的测定步骤。