蛋白质复性

重组包涵体蛋白质复性
邹平
基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。

重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。

但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。

随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。

一、包涵体蛋白
1、包涵体的形成
包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。

2、减少包涵体形成的策略
降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。

低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。

在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。

添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。

在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。

利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。

筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。

3、包涵体破菌、分离、洗涤
常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。

包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。

4、包涵体的溶解去折叠
一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。

盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，
尤其在碱性条件下，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多
肽链的自由氨基甲酰化。

高浓度的变性剂会严重破坏蛋白质的二级结构，产生不可逆变性，导致无法复性。

包涵体溶解时要采用尽可能低的变性剂浓度。

极端pH和变温被用来溶解包涵体，以替代高浓度的变性剂。

但高pH值会降解蛋白质的
N端。

用去垢剂SDS、TritonX-100、Sarkosyl等，破坏蛋白内的疏水键，溶解包涵体蛋白质。

对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间和链内的非活性二硫键，需加入还原剂，如巯基乙醇、DTT、二硫赤藓糖醇等破坏二硫键。

当蛋白表达量很高时，包涵体的在位溶解是一种非常有效的方法。

但在位溶解会引起许
多杂质成分的释放，导致蛋白质复性的收率下降。

二、包涵体蛋白质的复性折叠机制（几种假说）
蛋白质的一级结构完全包含了形成高级结构的全部信息，其组成中的氨基酸本身的特性
是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础。

多肽链的折叠是一个自发的过程，主要取决
于给定氨基酸的序列，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。

多年来，在蛋白质折叠的研究中存在许多假说，最初的假设都认为折叠步骤为：二级结构小片段形成折叠核，此核再形成功能区域，形成“熔球态”，此后，分子立体结构再做一些局部调整，最终形成正确的立体结构。

传统的化学动力学的模型集中研究此中间态转换机制。

近年来关于蛋白的折叠过程和机制的研究很多，多维能量观（Multidimensional energy landscape）学说或折叠漏斗（Folding funnel）比较有代表性。

多维能量观和折叠漏斗的模型可以预测蛋白复性的多动力路径，实验证明蛋白复性是远多
于“熔球态”一个折叠路径的。

而统计学的研究则侧重于蛋白向复性状态转换的整体能量观。

Dill, K.A的观点，认为蛋白复性更像多个球沿轨道滚落，而不是一个球在平面上漫无目的
的滚动。

可用能量和适合度的景观来解释，此能量景观把单个的微观行为和宏观的现象联系
起来，涉及折叠动力学的波动平衡，并发展了新型快速的计算方法。

折叠动力学应用微观理论和模型来研究，这个模型展示了蛋白折叠可用漏斗型的能量景
观来描述(如图1)。

漏斗的深度代表稳定构像的侧链相互作用的自由能，而宽度代表侧链的熵。

在低的位置，能量景观表示能量更低，更接近天然结构，此时构像就越少。

漏斗模型可
以模拟大量的变性分子从不同构像如何快速折叠为一个天然结构，但无法说明能量的屏障作用。

图1：此模型说明蛋白复性的能量景观像漏斗型。

还有研究人员从拓扑学的角度来解释蛋白的折叠过程，认为蛋白质折叠是由其拓扑学性质决定的，在无数空间结构中，具有生理活性的蛋白质结构是唯一的，并且此拓扑结构的熵值最小。

熵是度量系统无序度的函数，蛋白质的折叠过程是一个熵值不断减小、从无序的松散肽链到有序的活性蛋白质结构的演变过程。

这些构像的拓扑学分析中天然型的构像最稳定，热力学稳定性增加。

三、包涵体蛋白体外复性方法
复性是一个非常复杂的过程，与蛋白质复性的过程控制相关，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关。

1、传统方法：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

透析复性：不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，耗时长。

超滤复性：处理样品规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中产生不可逆的变性，在膜上聚集造成污染。

成功的复性方法是能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。

一是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。

在两次之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过易聚集的中间体阶段。

第二种方法是用温度跳跃策略。

变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠。

第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又能够引发正确复性。

2、添加辅助剂的复性方法：
在包涵体蛋白质折叠复性过程中，加入辅助剂能大大促进复性效率。

其作用为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体和非折叠蛋白质的溶解性。

通常使用的添加剂有：
（1)共溶剂
如PEG6000-20000，通过与中间体特异而形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集沉淀。

（2)去污剂及表面活性剂
如Trition X-100、SDS、CHAPs、Tween、磷脂、磺基甜菜碱等，对蛋白质复性有促进作用，但能与蛋白质结合形成微束，很难去除。

（3)氧化-还原剂
对于含有二硫键的蛋白，复性过程应促使二硫键形成。

方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法等等。

最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG，cysteine/cystine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也应用，氧化还原系统促进不正确形成的二硫键快速交换，提高了正确配对的二硫键的产率[61]；常使用1-3mM还原型巯基试剂，还原型和氧化型巯基试剂的比例常为10：1～5：1。

Hevehan认为这一比例关系应需随蛋白质浓度作调整。

空气中的氧是很好的二硫键氧化剂，很多包涵体蛋白成功地利用空气中的氧完成复性。

金属离子如Cu、Zn等常被用来作为催化剂。

还有一些特殊的氧化剂被用做控制包涵体蛋白的氧化复性，如：用O-iodosobenzoate 来氧化复性IFN-β，IL-2。

（4)小分子的添加剂
小分子自身并不能加速蛋白质的折叠，而是通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。

如盐酸胍或尿素等，可阻止蛋白聚集；蛋白质的辅因子（如Zn2+或Cu2+）、配基或底物亦起到很好的促折叠作用；加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率；L-Arg能使不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠朝着正确的方向进行。

；NDSBs可促进蛋白复性，它不属于去垢剂，不形成微束，易于去除；肝素具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会以提高复性效率；适量的盐可降低某些带电基团间的斥力，利于蛋白质的折叠；短链醇、高渗物等能有效地降低聚集体的形成，稳定蛋白的作用。

（5)添加分子伴侣和折叠酶
分子伴侣GroE家族的研究很多。

有些学者已成功地利用分子伴侣在体内和体外辅助蛋白质复性。

也有利用固定化分子伴侣，在体外辅助一些蛋白酶的折叠复性。

还有利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性。

“小分子伴侣”是GroEL的一个片
段，分子较小，更适合于固定化，不需另加复性辅助因子。

与分子伴侣辅助复性的作用机制相似，环糊精分子对去污剂分子有竞争性吸附作用，去污剂分子被剥离下来，从而使多肽链在此过程中正确折叠为活性蛋白质。

（6)单克隆抗体
待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限与抗体相对应的蛋白才能获得明显的助折叠作用。

（7)使用高压力复性蛋白。

3、液相色谱复性法
液相色谱复性的优点是：在进样后可很快地除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集；在蛋白质复性的同时，分离目标蛋白质与杂蛋白，达到纯化的目的。

有资料报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功地对变性蛋白进行了复性。

色谱法中，SEC的分离效果是最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。

耿信笃研制成功变性蛋白复性及同时纯化装置。

谷振宇等提出用脲梯度SEC复性：在SEC柱中预先制成自上而下脲浓度逐渐降低的梯度。

4、反胶束复性法
蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束内，这样使蛋白质相互分离，减少相互聚集，逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化-还原剂，使变性蛋白质复性。

5、双水相复性法
使用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统，PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用，这样正确折叠的蛋白质会不断从一相进入到另一相中，直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡。

目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，对某种蛋白质的复性必须反复试验，且没有普遍性。

只有利用折叠和聚集的知识才能建立相对优化、适合生产规模的蛋白质复性方法。

相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。

（作者单位：厦门伯赛基因转录技术有限公司）。