骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血

１ ＭＳＣ与脑出血的治疗 骨髓中存在造血干细胞和非造血干细胞，后者
是指ＭｓＣ等具有向非造血系统细胞分化的未成熟 细胞。ＭＳＣ来自中胚层，主要存在于全身结缔组织 和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐 血中也可分离得到。其形态多呈多角形和短梭形， 易于体外培养，增殖周期短，有贴壁生长特性，容易 诱导分化为多种组织细胞。目前，已在不同微环境 条件下将ＭｓＣ成功诱导分化为成骨细胞、成软骨细
经胶质细胞。神经干细胞的发现打破了神经元不能 再生的传统观念，为干细胞移植疗法用于神经系统 疾病的治疗提供了依据，使干细胞移植治疗成为近 年来的研究热点。然而，由于成年人体内干细胞含 量较少、取材不便，而且其应用受到伦理学和法律等 因素的制约，限制了其临床应用旧别。自体骨髓间质 干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭｓＣ）易于获取、分 离和培养，具有很好的迁移性，移植方法简单，因此 具有很好的应用前景＂Ｊ。
【关键词】 脑出血；骨髓间充质干细胞；细胞移植
Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｉ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎ枷ｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒａｉ ｈｅｍｏｎｔ蹿
ＸＵ Ｆａｎ，ＰＡＮ）（ｉｎｇ—ｈｕａ，ＬＩＵ Ｓｈｉ—ｘｉａｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｐｇａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｕｒｕｎｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ
。‘
２．４表面抗原和细胞鉴定 ＭＳＧ能表达多种表面抗原，但目前尚未发现一
种特异性细胞标记。Ｇｏｉｔｅｒ等…１利用流式细胞仪 对ＭＳＣ可能的多种细胞表面抗原进行研究发现，其 可特异性表达或部分表达ＣＤｌ０、ＣＤｌ４７、Ｓｔｒｏ．１抗 原、血小板衍生生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）受体、表皮生长因子受体、脂皮素５、组 织相容性白细胞抗原ｌ、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｅ、 ＣＤ５９、ＣＤ９０等抗原，同时发现其不表达ＣＤｌａ、 ＣＤｌ １ｂ（Ｍａｃ·１）、ＣＤｌ４、ａ砣７、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５和 ＣＤｌ３３等造血系细胞表面特异性抗原。Ｐｉｔｔｃｎｇｅｒ 等Ｉｌ刘研究发现，ＭｓＣ在细胞贴壁后均表达ＳＨ２、
３．４经侧脑室移植途径 Ｋｏｐｅｎ等¨引将小鼠ＭＳＣ用ＢｒｄＵ标记后．注入
新生小鼠侧脑室，１２ ｄ后ＭＳＣ迁移至整个前脑和小 脑，纹状体和海马内的ＭＳＣ开始表达ＧＦＡＰ，表明已 分化为成熟星形胶质细胞。Ａｒｎｈｏｌｄ等【２们将ＭＳＣ 注入成体大鼠侧脑室后发现，注入的细胞定位于室 管膜下区，并可转分化为神经元样细胞。不过，多次 输入容易引起颅内感染。
ｎｕｃｌｅａｒ ｇｒｏｔｅｉｎ，Ｎｅ州），８％的细胞表达ＧＦＡＰ，表明
ＭＳＣ在体内已分化为神经元和星形胶质细胞。 ＭｓＣ组小鼠神经功能恢复显著好于对照组。
３．６经静脉注射途径 ＭｓＣ可通过静脉途径输注移植。在接种前标
记ＭＳＣ，制成单细胞悬液，通过静脉输入。２周后处 死动物做脑组织切片，免疫组织化学染色分析表明， 患侧半球可见大量ＢｒｄＵ阳性细胞，而健侧半球 ＢｒｄＵ阳性细胞则很少。ＭｓＣ可到达脑损伤部位，呈 现以损伤为中心的梯度递减模式分布。这可能是因 为受损脑组织血脑屏障已遭破坏，或者与受损脑组
·２４·
骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血
·综述·
徐繁潘兴华刘诗翔
【摘要】 脑出血起病急骤、病情凶险、病死率很高，目前缺乏真正有效的治疗措施和药物。骨髓 问充质十细胞在特定微环境诱导下具有向多种细胞分化的潜能，而且已在不同微环境条件下将其成 功诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞等，为脑出血的治疗带来了新 的希望。
２．２体外诱导及向神经细胞分化【ｌｏ】 将培养２～４代的ＭｓＣ按２×１０５／ｍｌ密度接种
于铺有盖玻片的２４孔板中，以制备细胞爬片。培养 ２～３ ｄ后用含有ｌ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂ一巯基乙醇、２０％胎牛血 清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅ丌肌，ＦＢＳ）的低糖ＤＭＥＭ培养液预 诱导，２４ ｈ后ＰＢＳ洗涤３次，然后用含２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｂ· 巯基乙醇的无血清低糖ＤＭＥＭ培养液诱导５ ｈ。对 照组不加诱导剂，３ ｄ后换液，一直培养到第６天。
ａｎｄ ｉｔ ｃａｌｌ ｂｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌｓ．ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
ｃｅｌｌｓ，ｎｇｕｒｏｎｓ，ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，锄ｄ ＳＯ ｏｎ ｕｎｄｅｌ＂ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏ—ｅｎｖｉｒｏｍｎｅｒ吐ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｔ ｈａｓ ｂｒｏｕｇｈｔ
２０世纪９０年代末期，人们发现成年动物和成 年人脑内存在神经干细胞，其具有自我更新和多向 分化潜能，在一些特定条件下可分化为神经元和神
ＤＯＥ １０３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｒＬｌ６７３－４１６５２００９Ｄｌ ９０６ 作者单位：６５００３２昆明，解放军昆明总医院千细胞与组织器官 工程研究ｃ｝ｚ心 通信作者：潘兴华，Ｅｍａｉｌ：痂啦啊聊咆ｌｙ出∞．ｃｏｍ．ｇｌｌ
２ ＭＳＣ的获取
２．１原代培养和传代 在活体中，通过骨髓穿刺抽取骨髓；对于离体扁
骨（如肋骨），可在无菌条件下用ＤＭＥＭ培养液冲 洗骨髓腔获取骨髓。将所得骨髓过滤、除渣净化、离 心（或用密度梯度离心），去除红细胞，用吸管吹打 制成单细胞悬液，取有核细胞，镜下计数，接种在培 养瓶或培养基中，放人５％Ｃ０２孵育箱，３７℃下孵育 ２４ ｈ，换液，去除未贴壁细胞，则可得到所需的ＭＳＣ。 然后，传代培养ｌ １～１２ ｄ，当细胞达到９０％汇合时， 用０．２５％胰酶消化，再次镜下计数，制成一定浓度 的ＭＳＣ单细胞悬液，即可供回输使用¨Ｊ。
２．３诱导后细胞的鉴定¨０Ｊ ｐ．巯基乙醇作用２ ｄ，将诱导细胞用９５％乙醇
固定３０ ｍｉｎ，洗涤后正常山羊血清封闭，分别加入兔 抗大鼠ＮＳＥ多抗（１：１００稀释）、巢蛋白多抗（１：１００ 稀释）、胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｆｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）多抗（１：１００稀释），湿盒中４。Ｃ过夜 后洗涤，加人生物素标记的二抗，３７℃下孵育 ３０ ｍｉｎ，加入链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶溶液 在３７℃下孵育３０ ｍｉｎ，ＤＡＢ溶液显色，苏木素复染， 镜下观察，计数阳性细胞。
１１ｉｇｈ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ａｔ ｐｒｅｓｅｎｔ．ｉｔ ｌａｃｋｓ ｔｒｕｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｏｅｕｒｉｃ ｎ＇ｌｅａｓＨｒｅｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙ－
ｒｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈａｓ ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｄｅｒ ａ ｓｍｃｉｆｉｃ ｍｉＣＩ＇Ｏ．ｅｎｖｉｒｏｔｍｍ＇吐．
３．２病灶对侧半球内移植途径ｎ７】 将ＭｓＣ注射到病灶对侧半球内从而达到治疗
目的。这种方法可避免将ＭＳＣ置于缺少血液供应 和存在炎症环境的缺血或出血病灶内，并可避免将 细胞置于正在形成的液体囊腔中。
３．３立体定位移植途径¨刮 在立体定位下将ＭｓＣ直接注入脑内，虽然对脑
组织会造成一定的损伤，但一次性注入的细胞量可 以很大。在临床应用中，脑出血后在外科手术清除 血肿的同时可结合患者的影像学资料确定适合的靶 点，将细胞定位植入脑内特定部位，从而达到个体化 治疗的目的。
ａ ｎｅｗ ｈｏｖｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｌｘａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ．
一
－
．
●．
【Ｋｅｙ ｗａｎｉｓ】 ｉｎｔｒａｅｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ；ｒｔｌｅｓｅBaidu Nhomakorabeaｒｌｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
脑出血系指非外伤性脑实质出血，绝大多数由 高血压病伴发的脑小动脉病变在血压骤升时破裂所 致，起病急骤、病情凶险、病死率很高。脑出血后病 理学变化过程大致分为３个时期：（１）出血后３ ｄ内 为血肿周围脑组织缺血、水肿和坏死期；（２）从第 ４天起进入血肿吸收期；（３）第８天后血肿明显缩 小，继而进入瘢痕和囊肿形成期…。脑出血后，出 血灶中心区神经细胞死亡导致神经功能缺损，至今 尚缺乏真正有效的治疗措施和药物∽Ｊ。目前，有多 种措施可用于拯救病灶周围濒死神经细胞，细胞治 疗被认为是最有潜在应用价值的手段之一。
万方数据
国匠膻查壁痘盈查２Ｑ塑生！旦筮！Ｚ鲞箜！翅堡』堡堡匦！墼垡！：』璺些业２鲤！：№！：１２，坠地：！
·２５·
胞、心肌细胞、神经元和神经胶质细胞等。 近年来，许多实验室对ＭｓＣ治疗神经系统损伤
进行了不同方面和不同程度的研究№Ｊ。Ｗｏｏｄｂｕｒｙ 等＂１在体外成功地将ＭＳＣ诱导为能高度表达神经 元特异性烯醇化酶（ｎｇｕｒｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ，ＮＳＥ）的 神经元样细胞。有研究发现，注射到新生小鼠脑内 的ＭｓＣ可分化为神经元和神经胶质细胞，提示 ＭＳＣ可用于中枢神经损伤或退行性疾病的治疗。 近年来的研究表明，ＭＳＣ移植入动物受损脑组织后 可明显改善或加快神经功能恢复。Ｚｈａｎｇ等旧１将 ＢｒｄＵ标记的ＭＳＣ分别通过侧脑室、颈动脉和颈静 脉途径移植入脑出血大鼠脑内，观察到ＭｓＣ在海马 分化成神经元，在出血区周围分化成神经元和星形 胶质细胞，在同侧皮质分化成神经元、星形胶质细胞 和少突胶质细胞，颈动脉组和侧脑室移植组运动功 能显著改善。Ｄｅｎｇ等∽１发现，使用能提高细胞内环 磷酸腺苷浓度的诱导剂，如异丁甲基黄嘌呤、双丁酰 环磷腺苷等处理ＭｓＣ，６ ｄ后经免疫组织化学染色 分析发现，约２５％的ＭＳＣ分化为具有典型神经细 胞形态的细胞，并且神经细胞标记阳性率和阳性强 度显著提高。
ＰＬＡ，Ｋｕｒａｎｉｎｇ ６５００３２，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｎｇ Ａｕｔｈｏｒ：ＰＡＮ Ｘｉｎｇ－ｈｕａ Ｅｍａｉｌ：ｘｉｎｇｈｕｔｐｔ斯＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．Ｃｔｌ
【Ａｈｓａ＇ａｅｔ】 １ｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｉＳ ｏｆｔｅｎ ｓｕｄｄｇｎ ａｎｄ ｄａ／ｌｇｇｒｏｔｉｓ ｗｉｔｈ
织释放一些趋化因子有关Ⅲ】。ｓｅ蚵ｅｄ等旧３１的实
验表明，静脉注射ＭｓＣ可显著改善脑出血对神经功
能的影响。经静脉途径移植操作简单、方便，对受体 动物的损伤较小，但进入脑内的细胞数量较少。
３．７经颈内动脉移植途径’ Ｌｕ等Ⅲ１通过同侧颈内动脉给大鼠脑外伤模型
３．５经纹状体移植途径 ｕ等旧¨建立小鼠大脑中动脉闭塞（ｍｉｄｄｌｅ
ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，ＭＣＡＯ）模型４ ｄ后，在纹状 体内注射ＭＳＣ，２８ ｄ后处死动物发现，ＭＳＣ在脑内 存活，并迁移到距注射部位２．２ ｍｍ处。其中，ｌ％ 的细胞表达神经元特异性核抗原（ｎｅｕｒｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ＳＨ３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤｌ０６、ＣＤｌ２０ａ、
ＣＤｌ２４等多种表面蛋白，但不表达分化相关的标 志，如Ⅱ型胶原、碱性磷酸酶或骨桥接素；另外，培养 至１４ ｄ的ＭｓＣ仍为ＳＨ２、ＳＨ３阳性，而ＣＤｌ４、 ＣＤ３４、ＣＤ４５等造血系标志物检测则保持阴性。如 前所述，ＭｓＣ还可表达多种细胞因子、细胞因子受 体、黏附分子（整合素亚基０【３、甜、旺５、１３１、ａｖＢ３、 伽Ｂ５、细胞间黏附分子、ＣＤ４４等）和细胞外基质 （Ｉ、Ⅲ型胶原等），但这些抗原或是具有间质细胞 的抗原特征，或是具有上皮细胞和肌细胞的特征，因 此没有特异性¨３｜。目前，大多数学者认为来源于骨 髓单个核细胞群、在体外能够贴壁呈成纤维细胞样 生长、不表达ＣＤ３４的细胞即为ＭＳＣ。因此，通过细 胞表面抗原进行细胞鉴定的研究有待进一步提高。
３ ＭＳＣ的移植途径
３．１病灶同侧半球内移植途径 在病灶侧半球通过单个位点ｎ引或多个位点ｎ５］
将细胞注射人病灶内或其周围，从而达到修复脑组 织和改善功能缺损的目的。应用大鼠脑出血动物模 型，研究人员用该方法成功地将ＭＳＣ输送到大鼠脑
万方数据
·２６·
内，ＭｓＣ能在大鼠脑内存活、迁移和分化，并促进其 功能恢复¨引。