木质素测定

黄酮测定方法：
1. 黄酮的提取：精密称取鲜山楂叶1 g，加入5 mL70%乙醇溶液，充分研磨，定容至25 m L，室温（20℃）浸提4h，然后过滤至具塞试管得滤液体积，此滤液用于黄酮测定，测定时可根据情况进行稀释。

黄酮含量采用亚硝酸钠-氢氧化钠比色法测定，精密称取芦丁对照品20mg，加70%乙醇适量，加热使溶解，用100mL容量瓶定容，摇匀，即得0.2mg/mL标准液。

精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5，6 m L，分别置25 mL量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即用分光光度法，在510 nm的波长处测吸光度（A），以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线得回归方程: A=12.629C+0.0007 A: 510nm处测得的Abs C: 所测样品溶液黄酮浓度（mg/m L）
精密量取待测液2 m L于25 mL具塞试管中，加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即按照紫外－可见分光光度法，在510 nm波长处测吸光度值（A），按照回归方程计算含量。

（不同时期山楂叶黄酮含量及抗氧化活性变化向小林）
2.
样品溶液的制备：准确称取经过干燥和粉碎的急弯棘豆干粉3g，置于150mL的具塞三角瓶中，以料液比为1:14的40%乙醇作提取溶剂超声提取1h，提取温度为30℃，提取2次，过滤，合并滤液，滤液用石油醚3次萃取出叶绿素及可溶性脂类后完全移入100mL容量瓶，用甲醇定容，即得样品溶液。

对照品溶液的制备：准确称取在120℃干燥至恒重的芦丁54.2mg于100mL 容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，作为对照品溶液（芦丁含量0.542mg/mL）。

（1）直接测定法
分别取急弯棘豆黄酮提取液、芦丁对照品溶液各1mL于2个10mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，放置10min后进行扫描，用甲醇作空白，记录紫外可见吸收波长。

（2）硝酸铝显色法
分别取急弯棘豆黄酮提取液、芦丁对照品溶液1mL于3支25mL容量瓶中，加60%的乙醇到12.5mL，加5%亚硝酸钠1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝1mL，放置6min，加5%氢氧化钠10mL，60%乙醇定容至刻线，摇匀，放置15min后进行扫描，以不加样品为空白。

（棘豆属植物黄酮测定方法与超声波辅助提取工艺研究刘璐）
3. 黄酮含量的测定方法
芦丁标准曲线的建立：精密量取0.5mg ml-1芦丁标准溶液0 ml、1.0 ml、2.0 ml 、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 与6.0 ml，分别置于25ml量瓶中，加入0.7mL 5%NaNO2溶液摇匀，立刻加入0.7mL 10% Al (NO3)3溶液摇匀，放置5 min；加入5 mL 4% NaOH 溶液，用30%乙醇定容，混匀后放置5 min，于510 nm 处测定芦丁标准溶液的吸光度，对所测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程，并以标准溶液日的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线图。

植物样品的测定：取一定量的样品置于25mL容量瓶中，用30%乙醇稀释至10 ml；加入0.7ml 5% NaNO2溶液摇匀，立刻加入0.7 ml 10% Al (NO3)3 溶液摇匀，放置5min；加入5 ml 4% NaOH溶液，用30%乙醇定容。

混匀后放置5 min，在波长510 nm 处测定其吸光度值。

黄酮含量计算公式：X (mg g-1)=(C × V/V0 ×V1)/W
x:样品中的总黄酮含量(mg g-1)
C:显色溶液的总黄酮浓度(mg g-1)
V:显色溶液的体积(ml)
V0:比色时吸取样品提取液的体积(ml)
V1:样品提取液的定容体积(ml)
w:样品干重(g)
（植物次生代谢酚类物质含量的季节性变化及其对空气污染的响应张雅静）
4. 蕨类植物总黄酮的提取：将5种植物全株采集后清洗干净，自然晾干，75℃温度下于烘箱内烘干12h，粉碎．分别称取5种植物干燥恒重样品1 g于小锥形瓶中，加50%乙醇25mL，50℃水浴2h，超声20 min，进行抽滤，滤液收集，再在滤渣中加入50%乙醇25mL，50℃水浴2 h，超声20 min，进行抽滤，滤液收集，将两次滤液合并，弃滤渣，记录所得滤液的体积，测定滤液，即样液．
吸光度－芦丁标准曲线的制作
标准液的制备: 准确称取120℃干燥恒重的芦丁20mg，用95%乙醇溶解，定容至100mL，摇匀得到浓度为2 μg /mL的标准液．
标准曲线的制作: 准确吸取标准液0、1、2、3、4 m L分别置于10mL容量瓶中，加水至5 mL，加5%NaNO2 0.3 mL 摇匀，放置6 min，加5% Al (NO3)3 0.3 m L放置6 min，4% NaOH溶液4.4 mL，放置12 min.于510nm波长处测定吸光度。

绘制芦丁标准曲线
总黄酮含量的测定：精确吸取样液2mL于3支10 mL 的试管中，加水至5mL，再加5% Na NO2 溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。

加5% Al( NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。

加4% Na OH 溶液4.4 mL，放置12 min，以试剂空白作对照，于510 nm波长处测定吸收度。

（五种鳞毛蕨科植物总黄酮含量及抗氧化活性分析黄素楠）
木质素测定：
1.Klason lignin：称取0.5g(w1)干样，放人研钵中，加入20ml72%的浓硫酸，用研磨棒搅拌均匀室温静置4h，然后将混合液移至1000mL的磨砂口三角烧瓶中，加入765ml的蒸馏水，在电炉上回流煮沸2h，用已恒重的砂芯坩埚(w2)抽除过滤，再将坩埚放在供箱中105℃烘至恒重，取出称重(W3)并按下式计算出木质素的含量。

木质素含量=（w3-w2）/w1。

紫外分光光度法（乙酰溴法）:
称取0.006g干样，放入20ml试管中，加入5ml5%的溴乙酰一乙酸溶液和0.2ml的髙氯酸，塞好并密封，在70℃恒温水浴30min，隔10min振荡试管。

然后将反应液移入已装有10ml 2mol/l的NaOH和25ml的冰乙酸混合液的容量瓶中，振荡充分混匀后，用冰乙酸定容至100ml。

以冰乙酸为空白溶液，使用紫外分光光度计对样品溶液在波长200-600nm处进行扫描测定吸光度。

溶液吸光率=(木质素吸光度*定容体积）/(干重*Klason木质素含量)
木质素含量=（木质素吸光度*定容体积）/(干重*木质素标准吸光率)
吸光率的平均值作为标准吸光率
(缺硼对两种柑橘砧木木质素含量及其合成关键基因表达的影响)
2. 分别称取根部和茎部的风干样品100mg置于15ml反应瓶中，加入3ml72%H2SO4，25℃水解3h，并不断震荡，水解产物转入三角瓶中，加190ml超纯H2O于121℃反应1h，冷却，用已恒重（w1）的砂芯坩锅抽滤，滤渣用200ml热水反复洗涤，滤渣105℃烘至恒重，称得
重量（W2）并计算酸不溶性木质素含量（w2-w1）/w。

滤液补至500ml，在205nm波长下测滤液的吸光度。

当样品溶液的吸光度（A）在0.2-0.7之间时，根据公式（1），计算得酸溶性木质素含量ρ（mg/g）。

每个样品重复6次，取平均值。

ρ＝(A*D/110W)*1000
式中，D为样品溶液的稀释倍数。

(丹参木质素及其单体含量的测定宋银)
质谱
All biomass samples were analyzed for lignin content and
S/G ratio by analytical pyrolysis as described elsewhere (43
–
46). Brie
fl
y,
∼
4 mg
ground Populus material were pyrolyzed for 2 min at 500 °C, and the py-rolysis vapors were entrained in helium
fl
owing at 2 L/min to a mass spec-
trometer. Spectra were collected over an m/z range from 30 to 450 using
22.5-e V electron impact ionization. Lignin content was determined by
summing the relative intensity of the major lignin peaks (m/z ratios of 120,
124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 181, 182, 194, and 210) and
multiplying the sum by a correction factor calculated from the mass spec-
trum of a standard P. deltoides (NIST 8492; National Institute of Standards
and Technology) and its known absolute lignin content. S/G ratios were
determined by summing the intensity of the syringyl peaks at 154, 167, 168,
182, 194, 208, and 210 and dividing by the sum of intensity of guaiacyl peaks
at 124, 137, 138, 150, 164, and 178. All pyrolysis mass spectra are known to
be genetically controlled and heritable (47).
（Lignin content in natural Populus variants affects sugar release）
木质素总含量的测定
取经过80钼筛子的干苜蓿草粉100mg左右，将其放进试管中，用10mL的蒸馏水将其润湿然后在65oC恒温下震荡30 min后，用0.45 µm的尼龙膜进行过滤处理。

处理后的样品在40oC 烘箱中烘干48h。

把5mg的干燥样品添加到10mL的玻璃试管中25%溴化乙酰乙酸,然后将试管放在70oC 水浴锅中加热30min，每隔10min震荡一次。

当试管冷却到室温之后，将样品转移到装有10mL2MNaOHand10mL醋酸混合物的50mL的容量瓶中。

然后将0.5mL 7.5M的盐酸羟胺加入到容量瓶中，最后用醋酸定容到50mL。

在280nm下测定吸光度值,然后根据做的标准曲线计算木质素的含量。

每个样本3株植物。

每组实验重复3次。

木质素测定方法:
将风干样品磨成粉末，将样品用滤纸包裹起来，依次在甲苯-乙醇（2:1）,95%乙醇和水中用索氏抽提器进行抽提。

将样品在真空条件下进行烘干，取200mg烘干样品，将样品加入3ml 72%的浓硫酸中，在25摄氏度下酸钾3小时，期间可进行几次晃动。

（加水稀释至硫酸的浓度为3%。

煮沸回流4小时使多糖进一步水解成单糖,静置抽滤。

）（硫酸法测定花生壳中木质素的含量）
（将震荡好的样品转移至250ml的三角烧杯中，加蒸馏水111ml将硫酸浓度稀释至2.5%；小烧杯用蒸馏水清洗，将残留物转移至三角烧杯中，总体积115ml。

用报纸封住三角烧杯,放入高压灭菌锅(120℃条件下1h)。

）
（小麦木质素与茎秆强度的关系）
将酸解后的产物用烘干至恒重并称重的玻璃坩埚中进行抽滤。

滤液收集后用190ml的水进行稀释，然后用高压蒸汽处理1h。

然后稀释到500ml，在分光光度计A205处进行测定。

酸溶性木质素（g/l）=A205/110。

将坩埚在105摄氏度下进行烘干，烘干至恒重后称重。

（酸不溶性木质素含量）（Characterization of a cinnamoyl-Co A reductase that is associated with stem development in wheat）。