关联分析

应用STRUCTRE软件（Pritchard 2000），是对群体进行基于数学模型的类群划分，并计算材料相应的Q值（第i材料其基因组变异源于第k群体的概率）。

分析的大致理念是，首先假定样本存在K个等位变异频率特征类型数（即服从Hardy-Weinberger平衡的亚群，这里K 可以是未知的），每一类群标记位点由一套等位变异频率表征，将样本中各材料归到(或然率用Bayesian方法估计)第k个亚群，使得该亚群群体内位点频率都遵循同一个Hardy-Weinberg 平衡。

群体结构的问题探讨
一网友问了以下问题：
你好，我也想请问一下关联分析中遇到的几个疑问，
1.所谓的群体结构的消除是指群体结构越简单越好吗？为什么有的植物研究中分了好多的群，如果分布不是很均匀就是存在群体结构？
2.在群体结构分析过程中选择标记越多越好好，是每个染色体平均距离的选几个最合适？有没有明确的规定啊？
希望能得到您的赐教，谢谢
我的回复：
（1）首先需要搞清楚群体结构的定义（见以下幻灯）。

在现实群体中，很难有（a）类理想群体，因此在绝大多数情况下，我们在统计分析时都要将群体结构造成的伪关联考虑进去，而不是消除。

常见的办法就是应用STRUCTRE软件，进行基于数学模型的类群划分，计算材料相应的Q值（第i材料其基因组变异源于第k群体的概率）。

分析的大致原理是，首先假定样本存在K个等位变异频率特征类型数（即服从Hardy-Weinberger平衡的亚群，这里K 可以是未知的），每一类群SSR位点由一套等位变异频率表征，将样本中各材料归到(或然率用Bayesian方法估计)第k个亚群，使得该亚群群内位点频率都遵循同一个Hardy-Weinberg 平衡。

所得Q值会作为协变量纳入后续的关联分析的回归方程。

（2）群体结构分析过程中选择标记的多少，已有模拟研究的结果，详见文献：
Simulation Appraisal of the Adequacy of Number of Background Markers for Relationship Estimation in Association Mapping；Jianming Y u,* et al；Published in The Plant Genome 2:63–77. Published 18 Mar. 2009.；doi: 10.3835/plantgenome2008.09.0009
文章的建议是：
For Q，>1000 single nucleotide polymorphisms or 100 simple sequence repeats for maize. For K (a minimum of several hundred SNPs spread over the whole genome is recommended ...
选取标记时注意：标记距离要远些，距离近的标记不适合Structure软件分析,正如软件说明所述“The model assumes that markers are not in linkage disequilibrium (LD) within
subpopulations, so we can't handle markers that are extremely close together……..”
2.关联分析的优点
（1）不需要专门构建作图群体，自然群体或种质资源都可作为研究材料；
（2）广泛的遗传材料可同时考察多个性状大多数QTL关联位点及其等位变异，不受传统的FBL的“两亲本范围”的限制；
（3）自然群体经历了许多轮重组后，LD衰减，存在于很短的距离内，保证了定位的更高精确性
连锁不平衡和遗传连锁的关系
连锁不平衡并不等同于遗传连锁，它们之间既有联系又有区别：遗传连锁考虑的是两位点间的重组率是否等于0.5，一般来说，同一染色体上的任何两位点间都存在一定的连锁关系。

Ø 连锁不平衡考虑的是不同位点上基因之间的相关性，只要一个基因座上的特定等位变异与另一基因座上的某等位变异同时出现的几率大于群体中随机组合几率时，就称这两个等位基因处于连锁不平衡状态；当然，当两位点间处于紧密连锁状态时，其等位基因间可能存在较强的连锁不平衡关系。

尊敬的文老师，您好！我是山东农业大学的一名研究生，实验涉及小麦关联分析。

拜读您的文章，得知您是这方面的专家。

我在处理数据时遇到些问题，希望您百忙之中能给于解答，不胜感激！
1 、在LD分析中，
a 、我看到很多文献所进行分析的范围多是不一样的，有的是分析各个亚群的LD，有的分析不同染色体上的LD，也有的分析小麦染色体组的，请问他们分析的目的是什么，在什么情况下做何种分析比较好呢
b 、很多文献中分析同线性（同一染色体上）的LD和非共线的LD，并将非共线的LD作为背景LD，请问这个背景LD是不是要像分析群体结构似的随机挑一些标记运行，这个95%处的LD怎么取，将其作为baseline-LD来确定其他染色体上的遗传距离吗？我看有的文献是确定75%处的LD，
c、用来确定显著性的P值怎么确定呢，不同的文献采用的不同，0.05、0.01、0.001，我该选用哪个呢
d 、统计运行结果时，我要确定有多少对（位点组合）LD，平均的r*2值，显著性的LD对数比例是吗，假如我确定的p=0.01,则寻找pDiseq 这一项中小于0.01所对应标记对及它们的R*2值，是这样吗？
2、在群体结构分析中，除了STRUCTURE外看到很多的分析方法，像UPGMA、NJ聚类等，一篇文章里综合运用是为了互相验证、增强说服力吗，还是其他？
3、关联分析的数据结果该如何统计呢，如何确定显著性的P值？假如确定P=0.001，是不是要找这个性状P小于0.001所对应的那个标记呢？Heritability是不是就是这个标记对这个性状的遗传力？那运行结果中的F、Rsq-model、Rsq-marker、Residual又有什么作用呢，看
到很多文献中有群体结构解释表型变异的比例R*2, 这个值是从哪求出的呢？
祝好！
我的答复
你好，对你的问题回答如下：
（1）对各亚群（或染色体）做LD分析，无非是想了解各亚群（或不同染色体间）LD总体水平的高低差异及LD位点对数的差异。

举例来说，若有一自交作物种质资源群体由若干亚群组成，LD水平高（平均的D值或r方高）的亚群可能是选择压力大、个体数目少，群体结构明显等原因造成，我个人认为这种分析意义不大，因为在做关联分析时，很少使用单个亚群做为样本，而常常是用总群体来做分析，当然如是学位论文，可以作为一个研究方向充实内容，此外如国目的就是做LD分析，而不涉及关联分析解析性状，也可作为部分研究内容。

相比之下，不同染色体间LD水平的高低比较要有意义的多，如果某一条染色体的LD水平明显高于其他的，可以初步判断这条染色体受选择压力较大，多样性较低，在它上面可能载有较多的受人工进化选择影响较大性状的基因。

做这样的比较的前提是分析的标记数目较多，每条染色体都跑了标记且覆盖均匀，最好还要知道标记间的图距（或物理距离）。

对于不同小麦染色体组间的LD分析其目的，也大概和上面题到的目的相似，都是在探索一种基因组构成的基本信息。

（2）将非共线的LD作为背景LD方法很好，我现在查文献很不便，baseline-LD的论文还没看见过，你可以发给我看看在回复你。

（3）显著性的P值当然越小越好，0.001水平的肯定比0.05水平的位点更可靠，理论上说0.05显著即可认定关联，但实际操作过程中如果已0.05作为显著水平，可能会有太多标记关联上性状，其中可能有由于群体结构或kinship造成的伪关联标记。

建议起码选择0.01或更小作为显著水平，当然亦可使用bonferroni correction 确定显著值P=0.05/N,N is number of detected markers。

（4）"...则寻找pDiseq 这一项中小于0.01所对应标记对及它们的R*2值，是这样吗？",是，就是这样选的，在操作时可以按P值大小扩展排序后选得。

（5）STRUCTURE分析理念是基于亚群是否达到哈德温伯格平衡的数学模型的聚类，而UPGMA及NJ一般是基于材料间遗传距离的聚类，有时会有相似结果产生，但我认为没有比较的意义。

如果是要做关联分析，就用STRUCTURE分析群体结构好了。

（6）“....假如确定P=0.001，是不是要找这个性状P小于0.001所对应的那个标记呢....", 对，就是，寻找P小于等于0.001所对应的那些标记！
（7）Heritability是就是这个标记对这个性状的遗传力，F、Rsq-model、Rsq-marker、Residual，是对回归方程显著性检验的各项指标，分别指F值，模型解释率，marker的解释率，及残差。

Rsq是R square及R平方的缩写。

一般用”marker的解释率“较多
（8）你说有文献里”有群体结构解释表型变异的比例R*2“我不理解，一般都是标记或SNP对表型的解释率即Rsq-marker（marker 的R方）。

先回答到这吧，把baseline-LD的文献发来我看看。

上篇博文我提到了利用核心种质做关联分析的问题，严老师回复并不赞成用核心种质来做，这也让我忽然想起来当年我做博士论文时，想把中国农科院的核心种质纳入分析（最终没能如愿），当时导师对这一想法不以为然，他提醒我：“核心种质以外的材料就不重要吗？”，在多个场合导师也流露出对核心种质样本过分压缩及代表性的质疑，相反，导师更看重全国的育成品种，认为这些材料集中了非常多的优异基因型，这就有了继我发表作物学报那两篇拙文后，我们实验室张军的对全国育成大豆品种农艺性状进行了关联分析及优异等位变异传承的分析(同样也发在作物学报)，我个人认为虽然他的论文基本照搬我的分析思路，但实际意义要较我的大的多。

再回到最初的话题，严老师不赞成用核心种质原因，我估计有下列原因：
（1）核心种质的天生不足。

作物的核心种质的构建曾是九五、十五国家多项重大科研专项任务，然而，从这些项目立项到后来的实施、建成都有人质疑。

确实，核心种质构建的理念及统计分析方法本身就有待完善，此外，就拿我所了解的大豆核心种质而言，多样性的代表性是由SSR标记多态性评估的（我的很多研究生同学都曾为完成大豆核心种质的构建而夜以继日的跑板），然而这样选出来的种质地理跨度太大，成熟期差异巨大，很难找到一个地方能让所有核心种质正常成熟收获，更别说安排多年多点实验了！
（2）目标性状在核心种质中的变异不一定大，甚至不一定有！如果研究的是常规农艺性状，如开花期，株高等，我相信在核心种质中会有较大的变异幅度，然而对一些特殊品质性状，情况可能不容乐观。

（3）目前核心种质样本数还是偏小。

模拟结果显示关联分析的解析能力几乎与样本大小成幂指线性关系，目前玉米的巢式关联分析群体已建到了近5000个个体，相比之下国内主要作物的核心种质样本数真是小巫见大巫了。

以上是我的一些个人看法，不足之处还请严老师及同行指正。

同时在这里我也向关注我博客的各位同仁发起一个讨论议题“关联分析的材料到底如何选？”希望大家积极发表见解！
2010年全国玉米遗传育种学术研讨会
/z/yumi2010/index.html
严建兵：关联分析在玉米遗传改良中的应用
连锁不平衡的衰退距离是关联分析的关键~~~ 1-5KB
1、选择的材料
2、群体的大小
3、分子标记的类型
关联分析群体选择慎重群体结构
1、玉米中维生素A缺乏选育高维生素A源的基因600个材料1300多标记QTL 关联分析重组单株检测等位基因数目多
数量性状质量化株高突变体SNP
基因效应大小
开花基因没有主效基因有很多微效基因不基于主效基因的
关联分析对全基因组选择
标记的选择不是越多越好
两个平台：
1、材料平台：遗传研究材料以及育种研究所用的材料
2、表形鉴定平台：更加注重表形研究分析
(1)Status and Prospects of Association Mapping in Plants
Chengsong Zhu, Michael Gore, Edward S. Buckler, and Jianming Yu*
(2)Linkage disequilibrium and association studies in higher plants:
Present status and future prospects
Pushpendra K. Gupta*, Sachin Rustgi and Pawan L. Kulwal
(3)Methods for linkage disequilibrium
mapping in crops
Ian Mackay and Wayne Powell
(4)Genetic association mapping and genome organization of maize
Jianming Yu and Edward S Buckler
（5）The genetics of quantitative traits:
challenges and prospects
Trudy F. C. Mackay, Eric A. Stone and Julien F. Ayroles
（6）Simulation Appraisal of the Adequacy of
Number of Background Markers for Relationship
Estimation in Association Mapping
Jianming Yu,* Zhiwu Zhang, Chengsong Zhu, Dindo A. Tabanao,
（7）Association Mapping for Enhancing Maize
(Zea mays L.) Genetic Improvement
Jianbing Yan,* Marilyn Warburton, and Jonathan Crouch
国内：
植物数量性状关联分析研究进展
杨小红严建兵郑艳萍1余建明李建生
来源:TRENDS in Plant Science Vol.12 No.2 Methods for linkage disequilibrium mapping in crops 看来TRENDS in 这东
西可以多读下,因为里面的Glossary
Glossary
Admixture: intermingling of individuals from genetically different populations.
Analysis of variance: a method to test the statistical significance of differences
among several categories, rather than just two; in which case a t test is usually
used.
Candidate polymorphisms: polymorphisms that have not been chosen at
random to test for trait association, but for which prior knowledge exists: they
might be in a known linkage region or, for example, in a gene predicted to
affect the phenotype.
CentiMorgan (cM): a measure of genetic distance, additive over loci. At small
values, the distance in cM and the recombination fraction ( 100) are nearly
identical.
Chi-squared test: a widely used test of statistical significance.
Consanguinity or kinship: close genetic relationships between individuals. Drift: the change in allele frequency over time that results from sampling variation from generation to generation.
False negative: the declaration of an outcome as statistically non-significant, when the effect is actually genuine.
False positive: the declaration of an outcome as statistically significant, when there is no true effect.
Family-based linkage analysis: a method of mapping in which the coinheritance of markers and traits is related to known genetic relationships
between members of the same family or pedigree.
Haplotype: a set of genetic markers located on the same chromosome that are sufficiently closely linked and that tend to be inherited as a unit.
Landrace: an old cultivated form of a crop, potentially adapted to local growing conditions, but unimproved by contemporary plant breeding.
Linkage disequilibrium (LD): the non-random association of alleles at separate loci located on the same chromosome (see Box 1).
Logistic regression: a form of regression analysis in which the dependent variable is either 1 or 0, denoting presence or absence. Commonly used in human genetics and epidemiology with 1 denoting diseased individuals and 0 healthy or control individuals. It can also be used to regress the presence or absence of a particular allele at a locus onto a phenotype, as an alternative to the t test.
Mapping: the process of locating a genetic variant on a chromosome. Coarse mapping will only locate a variant within a broad interval. Fine mapping increases precision, ultimately enabling the identification of the functional polymorphism(s) responsible.
Mapping population: a set of individuals or lines, typically derived from an F2 or a backcross, which are used to construct genetic maps and to detect and locate QTL on those maps by family-based linkage analysis.
Marker: an identifiable location on a chromosome.
Microsatellite: repetitive lengths of short DNA sequences used as genetic
markers.
Multiple regression: regression analysis in which there are multiple independent
variables. In LD mapping, these could be multiple markers, within the
same or different genes.
Multiple testing: in an experiment involving many candidate polymorphisms,
many statistical tests will be carried out. A consequence of this multiple testing
is that it is more likely that a false positive result will be declared by chance.
Modified methods of significance testing can control the expected number of
false positive results.
Non-experimental population: a population not established specifically to map
markers or QTL. It is not necessarily a natural population. For example, it could
be a collection of breeders’ lines.
Population structure: the non-random distribution of genotypes among
individuals within a population.
Population subdivision: the partition of a population into subgroups such thatmost mating occurs within subgroups.
Quantitative trait locus (QTL): a polymorphic site contributing to the genetic
variability of a quantitative trait.
Recombination fraction: the fraction of meiotic events that show recombination
between a pair of loci.
Single nucleotide polymorphism (SNP): a polymorphism involving a change in
only a single nucleotide.
Stepwise selection: a set of methods in which the best subset of all
independent variables available for multiple regression is selected. Ideally,
only those variables that have an effect on the dependent variable are selected
and all others are rejected. In LD mapping, this approach attempts to separate
markers affecting a trait from those that do not.
Structured population: a population in which mating does not occur at
random.
t test: a test for the statistical significance of a difference between two means.
[转载]高级生物化学复习提纲
(2011-04-06 22:15:08)
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原文地址：高级生物化学复习提纲作者：夜泊孤舟接受天地
高级生物化学复习提纲
一、名词解释
别构效应（allosteric effect）：某种不直接涉及蛋白质活性的物质，结合于蛋白质活性部位以外的其他部位（别构部位），引起蛋白质分子的构象变化，而导致蛋白质活性改变的现象。

（2004，2007，2008）
亮氨酸拉链(leucine zipper)：由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在α螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。

当2α螺旋平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。

在“拉链”式的蛋白质分子中，亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同DNA结合。

（2007，2008）
网格蛋白(clathrin)：一种进化上高度保守的蛋白质，由分子量为180kDa的重链和分子量为35～40kDa的轻链组成二聚体, 三个二聚体形成包被的基本结构单位――三联体骨架(triskelion), 称为三腿蛋白(three-legged protein)。

有两种类型的轻链:α链和β链, 二者的氨基酸有60%是相同的，但还不知道它们在功能上有什么差别。

许多三腿复合物再组装成六边形或五边形网格结构,即包被亚基,然后由这些网格蛋白亚基组装成披网格蛋白小泡。

（2007，2008）
内部信号序列（internal signal sequence）：内含信号序列又称内部信号肽（internal signal peptide）,它不位于N端，但具有信号序列的作用，故称为内部信号序列，它可作为蛋白质共翻译转移的信号被SRP识别，同时它也是起始转移信号，可插入蛋白质转运通道，并与通道中的受体结合，引导其后的多肽序列转运。

内部信号序列是不可切除的信号序列，这是与N-端信号序列的一个重要区别。

由于内部信号序列是不可切除的，又是疏水性的，所以它是膜蛋白的一部分，如果共翻译转运蛋白质中只有一个内部信号序列，那么合成的蛋白质就是单次跨膜蛋白。

内部信号序列中含较多正电荷一端始终保持朝向胞质溶胶一侧，这也决定了有的多肽链N-端在胞质溶胶一侧，C-端朝向腔内。

有的则相反。

(2003，2007，2008)
信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP）：是一种核糖核蛋白复合物，沉降系数为11s，含有分子质量为72、68、54、19、14、及9kDa的6条多肽和一个7S（长约300个核苷酸）的scRNA。

SRP有3个功能部位：翻译暂停结构域（P9/P14）、信号肽识别结合位点（P54）、SRP受体蛋白结合位点（P68/P72）。

SRP能够识别刚从有利核糖体上合成出来的信号肽，并与之结合，暂时终止新生肽的合成；同时与内质网上的停靠蛋白结合，使核糖体附着到内质网膜上，并进行新生肽的转移。

SRP对正在合成的其他无信号序列的蛋白质无作用，这些游离核糖体也就不能附着到内质网膜上。

(2008)
锌指（zinc finger）：一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。

是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2＋构成，形成的结构像手指状。

（2008）
级联反应：化学修饰调节能引起酶分子共价键的变化，且因其是酶促反应，故对有放大效应，在这些连锁的酶促反应过程中，前一反应的产物是后一反应的催化剂，每进行一次修饰反应，就使调节信号产生一次放大作用。

（2008）
EF－手：也称为α螺旋－环－α螺旋，由E螺旋、F螺旋和螺旋之间的环组成，Ga2+与环结合，是组成Ga2+传感器蛋白的成分。

SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。

SD序列：在细菌mRNA 起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3′端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。

在原核生物中核糖体中与mRNA结合位点位于16S rRNA 的3′端，mRNA中与核糖体16S rRNA结合的序列称为SD序列(SD sequence)：它是1974年由J.Shine 和L.Dalgarno发现的故此而命名。

SD序列是mRNA中5′端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游3至11个核苷酸处,并且同16S rRNA 3′端的序列互补。

翻译同步转运（co-translational translocation）：蛋白质在游离核糖体中首先合成N末端信号序列（即内质网信号序列），信号序列介导核糖体与内质网膜结合，使新生肽链边合成边进入内质网腔，或插入内质网膜。

信号序列（signal sequence）：肽链N末端的16－30个氨基酸，含有1个或2个带正电荷的氨基酸残基，后面是6－12个连续的疏水氨基酸残基。

易位子（translocon）：新生肽链N端带正电荷，不易进入内质网膜。

内质网膜上提供蛋白质转运的水相通道称为易位子。

翻译后转运（post-translational translocation）：游离多聚核糖体上合成的蛋白质的运输，
肽核酸(PNA)也称为PNA(Peptide Nucleic Acid)：是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA 的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。

其特点是：1. 与核酸的杂交能力强于核酸间的杂交能力；2. 热稳定性高于核酸间的杂交体；3. 抗酶解能了极强，由于其非肽和非核酸的结构特点，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。

停靠蛋白（docking protein,DP）：含有两个亚基，一个亚基是暴露于细胞质的亲水部分，由640个氨基酸组成；另一个亚基是嵌入膜的疏水部分，由300个氨基酸组成。

DP是SRP 在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢结合。

使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上。

SRP受体蛋白已分离，且为一种G蛋白，它对分泌蛋白的转运具有重要的调节作用。

受体蛋白与GTP结合，表示是活性状态，能够与SRP结合，如果结合的是GDP是非活性状态，不能与SRP结合
免疫球蛋白（Ig）：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞产生一类具有抗体活性的球蛋白。

抗原决定簇：抗原物质表面决定抗原与相应抗体或效应T细胞发生特异性结合的某些特定的化学基团，这些化学基团叫做抗原决定簇。

12~23bp规则：J基因3′端7nt的七聚体（GTGACAC）与V基因5′端的七聚体（CACTGTG）互补，J基因3′端7nt的七聚体后间隔23bp无规则序列出现9nt的九聚体（TGTTTTTTGG）与V基因5′端的九聚体（ACAAAA- AAACC）互补。

这些保守序列之间以12±1或23±1bp 的间隔规律出现，称为12~23bp规则
GU-AG（或GT/AG）规律：内含子5′剪接点保守序列前两个碱基为GU，3′剪接点最后两个碱基为AG，被称为GU-AG规律
信号斑块：蛋白质分子中由于肽链折叠使不连续的肽段靠拢，而构成局部的立体结构，其功能与信号序列相似。

1不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。

1>浓缩效应：样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。

当通电后，在样品胶和浓缩胶中(pH=6.7)，解离度最大的Cl-有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6.0)泳动速度最慢，被称为慢离子。

由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。

电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。

这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。

因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。

2>电荷效应：当各种离子进入pH8.9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。

3>分子筛效应：由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。

此处分子筛效应是指样品通过一定
孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。

2凝胶过滤层析基本符合分配层析（Ve=Vo+Kd·Vi）的原理，请从Kd＝0时，Kd=1时，0<Kd<1时，分析被分离蛋白在柱床中的分配原理。

Kd为分配常数，表示某溶质分子可以进入凝胶颗粒内部空隙的分数。

当Kd = 1 时，意味着溶质分子完全不被排阻，它们可以自由进入所有凝胶颗粒的微孔中，在洗脱过程中将最后流出色谱柱外；当Kd = 0 时，意味着溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外，而最先被洗脱。

而对于中等分子，只有部分凝胶的空间能进入，其分配系数为0 < Kd < 1。

当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就决定了物质的流出顺序，即Kd小（分子量大）的先流出，Kd大（分子量小）的后流出。

3自分泌、旁分泌、细胞内自分泌和内分泌的分泌特征
自分泌：细胞分泌的激素对自身或同类细胞发生作用。

旁分泌：部分细胞分泌的激素，通过扩散作用于邻近其它细胞。

细胞内自分泌：一些激素没有信号肽，在细胞内合成后作用于细胞本身。

内分泌：激素从产生细胞合成后，通过血液循环输送到靶细胞而发挥作用。

外激素：从体内分泌的激素物质通过空气或水传播到远方，引起同种生物的行为或反应。

4从个体和细胞水平简述激素分泌调节
1>细胞水平的调控，也称为原始调节，有三种方式：
①能量水平调节（ATP/ADP）：ATP抑制能量产生的关键酶，而ADP则促进能量产生关键酶的活性。

②酶量调节：一些引起蛋白质合成的因素。