酶解蛋白粉中小肽含量的检测方法

发酵豆粕的检测除常规指标外，还应检测下列指标

酶解蛋白粉中小肽含量的检测方法

1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将酶解蛋白粉中的蛋白质和肽链较长的肽沉

淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经离心、过滤、消化、蒸馏，测定其蛋白质量。本方法是参照中华人民共和国轻工业标准大豆肽粉标准(QB/T2653-2004)基础上修订而来。

2、试剂及仪器：

１）100ml烧杯；

２）10ml，25ml移液管；

３）干过滤装置；

４）半微量粗蛋白质测定试剂和装置；

５）15%三氯醋酸溶液（TCA溶液）；

６）4000转／分钟的离心机。

3、方法：准确称取样品3克于100ml烧杯中，加入15%（三氯乙酸）溶液25毫升，

混合均匀，静置5分钟。将溶液定量转移，在4000转／分钟下离心10分钟后，取全部上清夜，用干的滤纸过滤，准确移取其滤液10ml于消化管中，按测定粗蛋白质方法消化、定容（100ml）、移取10ml消化液蒸馏，测定其粗蛋白质含量（半微量定氮法）。同时做空白试剂。

4、结果：

小肽％（占干基）＝｛(V－V。)×C(HCI)×6.25×0.014×2.5(25ml÷10ml)

×10(100ml÷10ml)｝÷m×100%

式中：V---样品消耗HCI的体积，ml；

V。---空白消耗HCI的体积，ml；

C(HCI)---盐酸的摩尔浓度moN；

6.25×0.014---蛋白质转换系数。

m---称取样品质量，g。

小肽％（占蛋白质）＝小肽％（占干基）÷粗蛋白质％×100

重复性：A)每个试样取两个平行进行测定，以其算术平均值为结果；

B)允许绝对便差为10%

C)以小肽占粗蛋白质的百分含量上报结果。

注：小肽含量还应减去氨基酸态氮

氨基酸态氮含量检测

1、原理

利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。

1)试剂

2)甲醛(36%)

3)氢氧化钠标准滴定溶液［c(NaOH)＝0.050mol/L］。

4)仪器

5)酸度计

6)磁力搅拌器

7)10ml微量滴定管。

2、分析步骤

吸取5.0mL样品，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混均后吸取20.0mL，置于200mL 烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液［c(NaOH)＝0.050mol/L］滴定至酸度计指示pH＝9.6［记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）的毫升数，可计算总酸含量］。

加入10.0mL甲醛溶液，混均。再用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）滴定至pH＝9.2，同时做好试剂空白试验。

3、计算

(V1-V2) XC1 X0.014

X1＝------------------- ×100

5XV3/100

式中：X1-----样品中氨基酸态氮的含量，g/100mL；

V1-----测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

V2-----试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；

V3-----样品稀释液取用量，mL；

C1-----氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；

0.014--与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液［c(NaOH)＝mol/L］相当氮的质量，g。

结果的表述：报告算术平均值的两位有效数。

酸度检测

乳酸的测定——NaOH 滴定法

取发酵豆粕样品10.00g，加蒸馏水90.00mL，搅拌30min 后，3000rpm 离心5min。取10.00mL上清液加入40mL蒸馏水后，用0.1M 的标准NaOH溶液(C)滴定，至溶液pH=8.2 为滴定终点。记录消耗的NaOH的体积，记为V (mL)。

乳酸含量（%）＝ C ×(V-V0) ×90.08 ×100%

C: 标准NaOH溶液的摩尔浓度（moL/L）

V: 样品消耗标准NaOH溶液的体积数（mL）

V0: 未发酵豆粕滴定消耗标准NaOH溶液的体积数（mL）

90.08: 乳酸的分子量

0.1M NaOH标准溶液的配制：

称取NaOH 4g，加水溶解后转移至1000mL容量瓶中，定容至刻度即可。（配制溶液所用水为煮沸并冷却后的蒸馏水。）

0.1M NaOH标准溶液的标定：

精密称取0.6g(准确至0.0001g)在105℃～110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加50mL新煮沸的冷蒸馏水，振荡使其溶解，加2 滴酚酞指示剂，用配制的NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色30 秒不退，同时做空白实验对照。

C NaOH = m / (V1-V2) ×0.2042

m: 邻苯二甲酸氢钾的重量（g）

V1: 标准NaOH溶液的用量（mL）

V2: 空白样消耗标准NaOH溶液的用量（mL）

1％酚酞乙醇溶液：

称取1g酚酞溶于100mL 95%的乙醇中。

豆粕中氢氧化钾蛋白质溶解度的测定

GB/T19541—2004

1、方法原理

氢氧化钾蛋白质溶解度可以反映大豆粕产品加热过度的情况。不同加热程度的大豆粕，氢氧化钾蛋白质溶解度不同。先测定大豆样品在规定的条件下，可溶于氢氧化钾溶液中的粗蛋白质含量；在测定同一大豆样品中总的粗蛋白质含量，计算出氢氧化钾蛋白质溶解度。

2、试剂

除非另有说明，在分析中使用确认为分析纯的试剂，所用的水为GB/T6682中规定的三级水。

0.2%氢氧化钾溶解：2.44g氢氧化钾溶于水中，稀释并定容至1L。

3、仪器、设备

1)实验室用样品粉碎机。

2)样品筛：孔径0.25mm。

3)分析天平：感量0.0001g。

4)磁力搅拌器。

5)离心机：转速为2700r/min以上。

4、样品的制备

取具有代表性的大豆粕样品，用四分法缩减分取200g左右，粉碎过0.25mm孔径的样品筛，充分混均，装入磨口瓶中备用。

5、测定步骤

称取大豆粕试样1.0g，精确到0.1mg置于250mL高型烧杯中，加入50.00mL0.2%氢氧化钾溶解，在磁力搅拌器上搅拌20min，将溶液转移至离心管中，以2700r/min离心10min，小心移取上清液15mL，放入消化管中，按的规定测定粗蛋白质含量，同时测定同一试样的粗蛋白质含量。

结果计算：

氢氧化钾蛋白质溶解度X，数值以质量分数表示，按式(1)计算：

W1

X=- ×100-------------------------------------(1)

W2