补肾活血化瘀方上调雄激素致不孕大鼠脂肪组织中胰岛素受体底物1及其酪氨酸磷酰化

补肾活血化瘀方上调雄激素致不孕大鼠脂肪组织中胰岛素受体底物1及其酪氨
酸磷酰化
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：李喜莲, 王针织, 俞超芹
【摘要】研究雄激素致不孕大鼠（androgen sterilized rat, ASR）胰岛素受体底物1的表达及其酪氨酸磷酸化程度，探讨胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的分子机制和补肾活血化瘀方的作用机制。

方法：ASR大鼠随机分为模型组、溶媒组（注射中性茶油）和补肾活血化瘀方组，各组均为15只大鼠。

观察大鼠体质量和胰岛素曲线下面积，并检测大鼠脂肪组织中胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1，IRS1）的表达及其酪氨酸磷酸化程度。

结果：模型组大鼠体质量和胰岛素曲线下面积高于溶媒组和补肾活血化瘀方组（P0.05）。

模型组脂肪组织中IRS1及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒组（P0.05），补肾活血化瘀方组IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化程度上升，与模型组比较有统计学差异（P0.05）。

结论：补肾活血化瘀方
能促进IR大鼠脂肪组织IRS1蛋白的表达及其酪氨酸磷酸化水平，这可能是其提高组织对胰岛素敏感性从而改善IR的机制之一。

【关键词】多囊卵巢综合征; 胰岛素抵抗; 胰岛素受体底物1; 酪氨酸; 磷酰化; 大鼠
Objective: To investigate the expression of insulin receptor substrate1 (IRS1) and phosphorylation of tyrosine in androgen sterilized rats (ASRs) and the effects of Bushen Huoxue Huayu Recipe (BHHR), a compound Chinese herbal medicine for tonifying kidney and activating blood, on the ASRs, and to analyze the possible mechanism.Methods: ASR models were established by means of testosterone injected subcutaneously at the age of 9 days. The model rats were randomly divided into BHHR group (n=15) and untreated group (n=15); the rats in normal group (n=15) were injected with oil. The rats in the BHHR group were treated with BHHR for 30 days, and the rats in model group and normal group were treated with distilled water for 30 days.Body weight and area under the curve (AUC) of insulin were measured after treatment. Expression of IRS1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in ASRs were analysed by immunohistochemical method.Results: The body weight and insulin AUC in the untreated group were increased and more than those in the BHHR group and the normal control group (P0.05). Expression of IRS1 and
phosphorylation of tyrosine in normal group were significantly higher than those in the untreated group (P0.05), and those in BHHR group were improved and significantly different from those in the untreated group (P0.05).Conclusion: BHHR can increase the expression of IRS1 and phosphorylation of tyrosine in adipose tissue in IR rats, which may be one of its mechanisms in improving insulin sensitivity of the target tissues.
Keywords: polycystic ovary syndrome; insulin resistance; insulin receptor substrate1; tyrosine; phosphorylation; rats 多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）是生育年龄妇女常见的内分泌疾病之一，临床上主要表现为闭经、月经稀发、不孕、多囊卵巢、高雄激素血症和持续不排卵，其发病机制不明。

近来研究发现，胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）在PCOS的发病中起重要作用［1］。

胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1, IRS1）作为胰岛素受体后信号重要转导分子之一，在PCOS合并IR 患者发病中起关键作用。

因PCOS发病原因复杂，临床表现多样化，目前尚无治疗该综合征的特效药。

中药补肾活血化瘀方（Bushen Huoxue Huayu Recipe, BHHR）为临床经验方，对PCOS有良好的疗效［2］。

王莉等［3］观察到雄激素致不孕大鼠（androgen sterilized rat，ASR）成年后具有高雄激素、高胰岛素、低促性腺激素、无排卵和多囊卵巢等表现，与PCOS有许多共同点。

本实验通过建立ASR 大鼠模型，检测大鼠脂肪组织中IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化的程
度，分析BHHR对ASR大鼠IRS1蛋白表达及其酪氨酸磷酸化程度的影响，以期阐明其治疗PCOS的可能分子生物学作用机制。

1 材料与方法
1.1 实验动物
32只3月龄雌性成年SD大鼠和8只3月龄雄性成年SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK（沪）20030003，由第二军医大学长海医院动物中心饲养。

合笼饲养［4］分娩8 d后选出雌性幼鼠105只用于实验。

1.2 药品和试剂
丙酸睾酮注射液、中性茶油（上海通用药业股份有限公司，批号050503）；BHHR（当归15 g、赤芍10 g、白芍10 g、桑椹20 g、枸杞子20 g、瓦楞子15 g、制首乌18 g、麦冬12 g等）由第二军医大学长海医院中药房提供，自制成浓度相当于含生药2.56 g/ml的水溶液，制备方法见前期报道［4］；大鼠胰岛素试剂盒（美国LINCO Research）；兔抗鼠IRS1单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗体（美国Thermo公司）；EnVision试剂盒（美国DaKo公司）；显色剂二氨基联苯胺（北京中山生物技术公司）。

1.3 ASR动物模型制备及分组
模型建立方法同前期报道［4］，并予中性茶油注射作为溶媒对照组。

模型组中制模成功的30只大鼠进入后续实验，剔除60只仍有性周期的大鼠。

将成模的30只ASR随机分为BHHR组和模
型组，每组15只。

溶媒对照组大鼠15只，70日龄后连续阴道脱落细胞涂片呈现动情周期。

各组大鼠在接受处理前体质量差异无统计学意义。

1.4 给药方式及剂量
各组大鼠断奶后均喂以颗粒饲料，80日龄起，按动物与人体表比换算法换算相应剂量，BHHR组灌服BHHR 10 ml/(kg·d)；模型组及溶媒对照组每天灌服同容积蒸馏水。

每天早、晚各1次，连续30 d。

1.5 ASR大鼠胰岛素曲线下面积测定
用药结束后参考大鼠性周期取材：有规律性周期的大鼠于110日龄后第一个动情前期取材；无规律性周期的大鼠于113日龄取材。

将大鼠称取体质量，当晚8点禁食，次日上午8点予50%葡萄糖溶液3 g/kg灌胃，在灌胃后0、0.5、1和2 h分别取眶静脉血，利用放射免疫法测定各时间点胰岛素水平。

药盒质量控制指标均符合要求，灵敏度0.1 ng/ml，批内和批间变异系数5.5％。

测定步骤严格按照说明书操作，计算大鼠血胰岛素曲线下面积（area under the curve, AUC）。

大鼠血胰岛素AUC＝1/4×空腹值＋3/4×60 min值＋1/2×120 min值。

1.6 各组大鼠IRS1及其酪氨酸磷酸化程度测定
处死各组大鼠后，取腹膜下脂肪组织，4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片，将标本置于58 ℃恒温干燥箱中烘烤24 h后，分别用兔抗鼠IRS1单克隆抗体、兔抗鼠磷酸酪氨酸多克隆抗体按EnVision 法进行免疫组化染色。

用PBS代替一抗作为阴性对照组，细胞质或
（和）细胞膜呈现棕黄色颗粒反应者为阳性，无棕黄色颗粒反应者为阴性。

采用上海求为生物科技有限公司MIQAS医学图像定量分析系统、医学图像定量分析软件进行免疫组化染色结果分析，计算阳性区域面积、阳性比率和光密度值。

IRS1表达及其酪氨酸磷酸化均以免疫组化阳性指数表示。

免疫组化阳性指数＝阳性面积×光密度值/总面积。

每张切片分析3个视野，每组数据至少18个。

1.7 统计学方法
采用SPSS 11.0软件进行统计分析。

计量资料数据用x±s表示，采用单因素方差分析（q检验），各组之间方差齐者用最小显著差异t 检验。

相关数据分别采用非参数符号等级检验（Wilcoxon检验）及非参数两样本等级秩和检验。

计数资料进行χ2检验。

2 结果
2.1 各组大鼠体质量情况
模型组大鼠体质量高于溶媒对照组（P0.05）；BHHR组大鼠体质量与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05）。

见表1。

表1 3组大鼠体质量和血胰岛素曲线下面积（略）
2.2 各组大鼠胰岛素曲线下面积
模型组大鼠血胰岛素曲线下面积大于溶媒对照组（P0.05）；BHHR组血胰岛素曲线下面积与模型组比较，差异有统计学意义（P0.05）。

见表1。

2.3 各组大鼠IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化程度
模型组IRS1表达及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒对照组
（P0.05），BHHR组IRS1表达及其酪氨酸磷酸化程度上升，与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）。

见表2和图1、2。

表2 各组大鼠IRS1及其酪氨酸磷酸化情况（略）
3 讨论
3.1 IR与PCOS
多年来下丘脑垂体卵巢生殖功能异常一直被认为是PCOS主要的病理基础。

自1980年Burghen等［5］首次提出IR参与PCOS 的发病后，对PCOS的本质及其发病机制有了新的认识，越来越多的学者认为，IR及高胰岛素血症（hyperinsulinism, HI）不仅是PCOS 的另一重要生化特征，而且可能是PCOS发生的主要病理基础［6］。

IR是亚细胞、细胞、组织或机体的一种病理生理状态，即外周组织器官对胰岛素的敏感性降低、受损或丧失而产生的一系列生理变化和临床表现。

机体为维持正常的血糖，代偿性增加胰岛素的分泌，导致HI。

HI刺激卵巢和肾上腺的细胞色素p450 17α酶mRNA的表达而使雄激素合成增多，p450 17α酶具有17羟化酶和17、20裂解酶的双重活性，使卵巢分泌的睾酮增多和肾上腺分泌的硫酸脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone sulfate, DHEA S）增多［7］。

有研究发现，过多的雄激素可使动物卵巢颗粒细胞死亡，并可引起人黄体细胞缺陷，同时保留了卵巢对黄体生成素（luteinizing hormone, LH）的高反应性［8］；而高黄体生成素（HLH）又可促进卵巢产生过多雄激素并在外周组织经芳香化酶的作用，转化为雌酮，持续作用于下丘脑和垂体，对LH分泌呈正反馈而对卵泡刺激素（follicle stimulating
hormone, FSH）分泌呈负反馈，加强并维持HLH作用，导致PCOS 持续性无排卵和高雄激素（hyperandrogenism, HA）血症。

本研究结果发现模型组大鼠血清雄激素、各时间点胰岛素水平、胰岛素曲线下面积均明显高于溶媒对照组，提示PCOS发生IR时，机体为维持正常的血糖水平，代偿性分泌较多胰岛素而出现IR，最终导致HA，而HA又可加重IR，两者形成恶性循环。

3.2 IRS1与IR
目前IR的确切机制尚不清楚，研究认为其主要原因是胰岛素受体后信号传导障碍［9］。

IRS1有胰岛素细胞内信号传导的“船坞”蛋白之称，在胰岛素信号转导途径中发挥着重要作用［10］。

胰岛素与其受体α亚基结合后，在使β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化的同时，使IRS1的多个酪氨酸残基发生磷酸化，激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidy linositol 3kinase, PI3K），活化后的PI3K促进细胞内葡萄糖转运载体囊泡易位至细胞膜上，从而促发葡萄糖转运蛋白4表达增多，组织对葡萄糖的摄取增加。

PCOS患者脂肪组织中IRS1及其酪氨酸磷酸化明显减低，而这种信号分子的改变，使PI3K的活化受阻，使生物学效应发生改变，导致IR的形成［11］。

本实验采用免疫组化法检测ASR大鼠脂肪组织中IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化程度，发现两者均明显下降，与溶媒对照组比较有统计学意义。

因此，IRS1结构或功能异常可能是造成胰岛素作用的外周靶组织，特别是肝脏、脂肪及骨骼肌发生IR的重要原因，这可能是PCOS IR的发生机制之一。

3.3 BHHR对ASR IR的作用
由于目前PCOS发病的确切机制尚不清楚，患者大多依靠药物对症治疗，所以临床取材非常困难，为此寻找一种理想的病理研究模型开展其病因的基础研究以便指导临床诊断和治疗显得非常重要。

本实验采用注射丙酸睾丸酮方法建立不孕大鼠模型，观察BHHR对大鼠体质量和胰岛素曲线下面积的影响，从IR大鼠脂肪组织中IRS1的蛋白表达及酪氨酸磷酸化水平的角度来探讨其作用机制。

结果表明，与溶媒组比较，模型组大鼠的体质量和胰岛素曲线下面积及各时间点胰岛素水平明显升高，提示本实验所用动物模型符合IR的特征和基本要求，是理想的IR动物模型。

应用中药BHHR干预后，绝大部分大鼠恢复性周期，且体质量、胰岛素曲线下面积下降，提示BHHR 能有效改善IR大鼠的胰岛素抵抗状态，提高胰岛素的敏感性。

免疫组化结果提示，模型组IRS1表达及其酪氨酸磷酸化程度低于溶媒组（P0.05），BHHR组IRS1表达及其酪氨酸磷酸化程度上升，与模型组比较有统计学差异（P0.05）。

BHHR能改善脂肪组织中胰岛素受体后信号传导异常，其主要作用位点可能在IRS1的蛋白表达及其酪氨酸磷酸化环节。

ASR大鼠脂肪组织中IRS1的表达及其酪氨酸磷酸化减低，可能是其IR的病理机制之一。

利用BHHR不仅可使ASR大鼠体质量减轻，恢复性周期，降低血清雄激素和胰岛素水平，从而改善IR，而且可以使大鼠脂肪组织中IRS1的表达量明显上升，IRS1酪氨酸磷酸化增强，从而提高组织对胰岛素的敏感性，这可能是其改善IR的作用
机制之一。

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