汇总资料cho细胞蛋白表达系统

大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。

CHO 细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。容易发生基因突变，也较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase）营养缺陷型突变细胞株（CHO/dhfr-）、转染谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）基因的GS-CHO 细胞。

二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二

氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr 突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，因此不能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸苷

（thymidine），则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr 基因进行筛选时，首先将重组DNA 分子导入dhfr- 表型的受体细胞，然后撤除原培养基中的的次黄嘌呤和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌呤和胸苷的培养基。另外，氨甲喋呤（MTX）选择压力可

使CHO/dhfr- 细胞的外源基因的拷贝数扩增并得到较高水平的表达。

CHO-GS 细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS 基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。

近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO 细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。

与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：

(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；

(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；

(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；

(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；

缺点：

CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。

Cho细胞的培养

CHO 细胞血清培养

传统上CHO 细胞的培养都是在DMEM／F12 基础培养基中添

加5~10 的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合

成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。

从重组蛋白生产的角度来看，出于Q 和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达

血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO 细胞培养的一种必然需求。

CHO 细胞的无血清培养基

由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，因此要找到血清替代物是相当困难的。目前已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。促生长因子是无血清培养基的主要补

加物之一。

从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。现已证明很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。另外，脂类是细胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖。

无血清培养的方法

细胞的无血清驯化过程如下：

取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。

细胞驯化可以在方瓶（T-flask）、摇瓶（shake-flask）或转瓶（spinner-bottle）中进行。

将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1：1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2－4×105cells/ml的细胞，在37℃、5％CO2培养箱进行培养。

根据细胞生长和活率情况，在降血清的每一阶段可稳定传代1－3代，接种密度维持在2- 4×105cells/ml。

逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，传代过程的细胞接种密度仍维持为2- 4×105cells/ml。

直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90％后，此时可将细胞完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。

在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库。

无血清培养试验步骤

1．实验材料

CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司。

2．实验方法

2.1 无血清培养基的配制 ' n ^1 c* Y6 n" [8 J h

用90ml 纯水溶解制备1 升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03，用 1M NaOH 将pH调为8.0，再用1M HC1调回至pH7.1，定容后用0.22μm滤器过滤除菌。

2.2 CHO 细胞的适应