急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建的研究

急性髓性白血病患者异基因造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建的研究
（作者：_________ 单位：___________ 邮编：___________ ）
作者：吴秀丽李扬秋朱康儿，杨力建陈少华，卢育洪陈洁，刘启发
【摘要】目的：监测急性髓性白血病（AML）患者接受异基因造血干细胞移植⑻Io HSCT后外周血中的T细胞受体重排删除环（TRECs）水平，了解移植后早期的T细胞免疫重建情况。

方法：AML患者15例分别在allo，HSCT前以及allo HSCT后每隔2周收集外周血，采用
实时定量PCR法检测外周血单个核细胞（PBMNCs中的TRECs水平; 7 例年龄相近的正常人外周血样本作为对照。

流式检测CD45RA B胞亚
群和CD45RO+胞亚群的阳性率。

结果：allo HSCTfi移植前的TRECs 平均拷贝数为（1.42 士 1.51）拷贝/1000 PBMNCs,明显低于正常组的（3.03 士0.45）拷贝/1000 PBMNCs水平;移植后第12 周的TRECs平均拷贝数为（1.67 士 1.93）拷贝/1000 PBMNCs与正常相比仍然较低。

移植后8周内以CD45RO+/CD4+胞的扩增为主，而外周血TRECs水平在allo HSCT后4周左右出现短暂地升高趋势，随后又下降，至
allo HSCT 8周后才开始稳步上升。

有急性移植物抗宿主病（aGVHD）
病史的移植患者的外周血TREC水平显著降低，明显低于无aGVH病史移植患者的外周血TRECs水平。

3例移植后早期复发的患者的外周血TRECs水平降至基线水平或检测不到。

结论：不同个体T细胞免疫重建时间存在差异；AML患者在allo | HSCT后早期（90 d内）的胸腺输出功能仍处于恢复阶段，移植后4周内的免疫重建仍以来源于供者细胞的外周扩增为主；夕卜周血TRECs水平可能与AML患者allo HSCT后病情的发展、转归有关。

【关键词】造血干细胞移植，异基因；T细胞受体重排删除环；免
疫重建
异基因造血干细胞移植（alloge neic hematopoietic stem cell transplantation, allo I HSCT是目前治疗急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia, AML等恶性血液病的有效方法之一，已广泛应用于临床。

造血干细胞移植后造血功能的全面重建主要包括两个方面，即造血细胞数量和功能的恢复，后者主要是指免疫功能重建。

临床上往往将中性粒细胞和血小板的恢复作为造血恢复的指标，容易
忽视免疫功能的恢复。

免疫功能重建现在被认为是评价移植疗效的重要因素之一，allo HSCT后重建T细胞特异性免疫功能，需要来源
于胸腺依赖途径所产生的初始T细胞，即经胸腺发育而输出的
na ve细胞，而目前能够作为na鹘ve T细胞的标志的是T细胞受体删除DNA环（T cell receptor excision DNAcircles, TRECs）［1-3］。

为了解AML患者接受allo HSCT后早期的T细胞免疫重建情况，我
们对其胸腺近期输出功能（外周血TRECs水平）进行了监测，并对外周
血CD45RA+/CD4+CD45RO+/CD4及CD45RA+/CD细胞亚群进行了
流式细胞术分析。

1对象和方法
1.1对象接受allo • HSCT台疗的AML患者15（男13,女2）例，年龄18〜56（中位年龄35.7）岁，其中M25例，M32例，M45例，M5 3例；供者为HLA位点完全相合同胞或无关供者；采用联合氟达拉宾的减量清髓预处理方案；移植后受者全部植活（中性粒细胞连续3d > 0.5 X 109/L为粒细胞植活，血小板连续7 d >20X 109/L为血小板植活）,所有受者移植后均为完全供受者嵌合体；所有患者allo HSCT后临床上未采用改变细胞亚群数量的特殊治疗方案，并
均告知同意及医院伦理委员会同意。

分别于移植前、移植后每间隔
2周收集患者外周血样本；同时收集7例与移植组年龄相近的正常人（均为男性）外周血样本作为对照，年龄17〜48（中位年龄31.6）岁。

1.2方法
1.2.1流式细胞术检测CD45分子表达和DNA提取按常规方法收集各样本的外周血单个核细胞（PBMNCs）,计数后一部分细胞用于免疫荧光标记（鼠抗人CD4+ CD8+、CD45RA CD45ROmAb, Fermentas）, 利用流式细胞术进行CD45RA+/CD4+CD45RO+/CD4及CD45RA+/CD8+ 细胞亚群阳性率的检测；剩余细胞提取DNA（QIAprep Spin Miniprep Kit, QIAge n）, 并用紫外分光光度计检测DNA勺浓度及纯度。

1.2.2引物设计从T细胞受体（TCR）5基因组序列（ACCESSION AE000661冲于5 Rec基因片段的下游设计一下游引物（T1）和在® J a
的上游设计一上游引物（T2）[2],引物的方向恰好与一般的PCR引物相反（所检测的是3 Rec和® J a的两个基因片段删除后重组形成的环形DNA,即TRECs）,并在该扩增片段中间设一荧光素标记探针（T3）; 选择RAG2基因作为细胞定量对照：分别在RAG2基因组序列（ACCESSION M9463中设计一对引物（R1和R2）及一荧光素标记探针（R3）。

弓I物和探针由德国柏林TIB生物公司合成。

1.2.3 RAG2 TREC标准品的构建利用两对引物分别扩增所需的
RAG2和TREC啲基因片段，经序列分析证实后分别将其连接到TA载
体上（TOPOTA Cloning Kit, Invitrogen）, 转入感受态细菌扩增，抽提、纯化质粒后再经酶切、PCR和测序证实目的基因片段的准确性；用凝胶电泳和紫外分光光度计检测质粒的浓度及纯度，根据质粒分
子量换算为拷贝数，稀释标准质粒，将其调整为梯度浓度：107、106、105、104、103、102 和10 拷贝/2 卩L。

1.2.4 实时定量PCR每一标本分别检测2次RAG告口2次TRECs, 总反应体积为25卩L,其中含标准品2卩L或约100 ng基因组DNA, 0.5 卩moL/L引物，0.2 mmoL/LdNTP, 1.5 UAmpli TaqGold（ABI, USA）, 0.1 □ moL/L 的6 FAMTAMR探针和PCF缓冲液（含4
mmoL/LMgCI2）。

在95C 10 min变性后，共进行45个循环扩增，每一循环包括95C 30 s 和64 C 1 min。

反应在MJ Optic on Mo nitor（BIO RAD）中进行。

反应分别设标准组（7个浓度）、阳性对照组（两个平行反应）、阴性对
照（两个平行反应）及样品组。

1.3统计学分析根据所检测样本中RAG2的实测数值来确定所检测样本中所含的细胞数(每个细胞含2个RAG2拷贝),然后计算每1000个PBMNC中所含的TRECS拷贝数，计算公式为：n=2 x 1000X [TRECs(1)+TRECs(2)]/[RAG2(1)+RAG2(2)]; 使用SPSS 13.0 软件包进行统计学处理，采用非参数检验的Mann ■ Whitney U检验进行组间比较；各组样本中的平均TRECs水平以x士s表示。

2结果
2.1 allo ■ HSCT后CD45RA细胞亚群及CD45RO细胞亚群阳性率的
变化allo HSCT后各时间组的CD45RA细胞亚群和CD45RO细胞亚群的
平均阳性率显示出一定的变化趋势(图1)。

CD45RO+/CD4+
CD45RA+/CD8细胞亚群的阳性率在移植后第4周时均明显较低，随后逐步上升，8〜12周又出现下降趋势；CD45RA+/CD4鈿胞亚群的阳性率在移植后12周内均维持在较低水平；移植后8周内以CD45RO+/CD 4+胞的扩增为主。

图1 allo HSCT后90 d内CD45RA细胞亚群及CD45RO细胞亚群
阳性率变化2.2实时定量PCR的敏感性、重复性和特异性最大敏感性可
达到10个拷贝/卩L,且1X 107〜1X 102拷贝/卩L的重复性良好；模板在10个拷贝数以下时结果不稳定，故将检出限为10拷贝数以上；经电泳可见到符合目的片段大小的条带(RAG2为245 bp, TRECs为390 bp)。

标准曲线的斜率(slope)均为-0.28,系列稀释的标准品浓度与循环阈值具有较好的相关关系(r=0.996, 0.998)。

无模
板对照未见任何扩增。

2.3 allo ■ HSCT后外周血TRECs水平的变化PBMNC中的TRECs 水平有着较大的个体差异。

正常对照组外周血中的TREC平均拷贝数
为（3.03 士0.45 拷贝/1000 PBMNCs）; allo HSCT组移植前的TRECs 平均拷贝数为（1.42 士 1.51拷贝/1000 PBMNCs）,明显低于正常组（Mann Whitney U检验，P0.05）。

移植后TRECs水平的变化也有较大个体差异，移植后各时间组的平均TRECs水平存在着一定的变化趋势，其中7例allo HSCT后90 d内未发生GVH啲患者的TRECs 水平变化见图2。

在allo HSCT后4周左右，外周血TRECs水平出现短暂的升高趋势，但维持时间不长，随后又复下降；在allo HSCT后第8周时，夕卜周血TRECs水平降低最为明显，接近或
达到基线水平；之后TRECs水平开始缓慢平稳上升，移植后第12周的TRECs平均拷贝数为（1.67 士1.93拷贝/1000 PBMNCs）,虽然稍高于移植前水平，且有1例患者的TREC水平已经达到甚至超过正常人平均水平，但总体与正常对照组相比仍然较低（Mann. Whitney U检
验,P0.05）。

allo I HSCT后有急性移植物抗宿主病（acute graft vs host disease, aGVHD）病史的移植患者（3例发生肠道aGVHD, 2例发生皮肤aGVHD 外周血TRECs水平显著降低（0.07 士0.14拷贝/1000 PBMNCs）,明显低于同时期无急性GVH病史的移植患者外周血TRECs 水平（0.82 士1.12 拷贝/1000 PBMNCs）,甚至趋于基线水平（Mann Whitney U检验，P0.05）。

此外，还观察到3例移植后早期复发的患者的外周血TRECs 水平降至基线水平或检测不到。

3例
AML（M5的患者移植前外周血TRECs水平分别为1.03、4.03、3.12 拷贝/1000 PBMNCs,移植后2个月时其外周血TRECs水平均降至基线水平或检测不到，随后临床发现AML复发。

图2 allo HSCT后90 d内的外周血TRECs水平变化
3讨论
TRECs是T细胞受体a基因重排形成过程中需删除TCRS基因而产
生的环形DNA,它的含量代表了TCR基因初始重排形成有功能TCR 基因时的na ve T细胞的含量。

通过实时定量PCF检测TRECs水平以确定na ・ve T细胞含量，能够确切地了解胸腺新近输出na ve T 细胞的功能，帮助进一步了解移植后T细胞免疫重建情况。

国外自2000年始将TRECs的定量检测用于白血病骨髓移植后免疫功能重建的分析，我们也曾将其用于检测正常人外周血T细胞、慢性粒细胞白血病患者和苯中毒患者胸腺近期输出功能［2-4］,但将TRECs水平检测用于AML患者移植后早期T细胞免疫功能重建分析，国内尚未见报道。

既往的研究已发现胸腺近期输出功能随着年龄的增加而逐渐下降，且受者的年龄是移植后T细胞免疫重建的重要影响因素
［1,5］。

本研究中allo HSCT组的年龄与正常组的年龄相近，可
以排除年龄分组差异对TRECs含量检测的影响，可以进行allo H SCT S与正常组的TRECs水平的比较。

外周血中TRECs水平
有着较大的个体差异，allo HSCT组移植前的TRECs平均拷贝数为(1.42 士1.51)拷贝/1000 PBMNCs,明显低于正常组(3.03 士0.45拷贝
/1000 PBMNCs)(P0.05),提示由于移植前原发病及化疗药物的影响，虽然
移植前AML患者处于缓解期，外周血和骨髓细胞检查基本正常，但其胸
腺近期输出功能仍然相对较低。

CD45RO+/CD4+ CD45RA+/CD8细胞亚群的阳性率在移植后第4 周时明显降低，随后逐步上升，8〜12周又出现下降趋势，并且移植后8周内以CD45RO+/CD4+■胞的扩增为主；而外周血TRECs水平在allo HSCT后4周左右出现短暂的升高趋势，后又复降，至allo HSCT后第8周左右才开始稳步上升。

这些结果提示移植后早期免疫重建仍以来源于供者细胞的外周扩增为主，移植后8周之后
方显示出经胸腺发育而输出的na ve细胞的情况。

既往的研究报道成年患者的TRECs水平在移植后随着时间的延长而逐渐恢复，一般在移植2年后可恢复到正常水平，但也可能由于原发病和预处理方案等因素影响而存在较大的个体差异[6]。

本研
究中的大部分AML患者在allo HSCTB 12周左右的TRECs水平可稍
高于移植前水平，但总体与正常相比仍然较低，提示AML患者移植后虽然达到了临床缓解，但其TRECs水平较正常水平低，说明其胸腺输出功能仍处于恢复阶段，T细胞免疫功能尚未达到完全重建。

我们还发现allo . HSCT后无论是正在进行的急性GVH还是曾发生过急性GVHD,都能导致外周血TRECs水平低下，提示急性GVH呵能导致胸腺功能的损伤，抑制了胸腺依赖途径的T细胞免疫重建。

发生GVHD 患者的TRECs水平降低，一方面可能是GVHD寸胸腺上皮细胞的损伤而导致胸腺功能的低下，另一方面也有可能是相关免疫激活使T细
胞分化、增殖加快而稀释TRECs的结果。

另外，国外有学者提出TRECs水平可能作为造血干细胞移植后疗效及预后的评价指标[7],
我们亦发现3例allo丨HSCT后早期复发的AML患者复发后未检出TRECs水平(复发前为1.03、4.03、3.12 拷贝/1000 PBMNCs),提示外周血TRECs水平可能与AML患者allo ‘ HSCT后病情的发展、转归有关。

我们初步提供了AML患者allo | HSCT后早期的胸腺近期输出功能恢复情况，有助于正确评价T细胞免疫重建，为评估临床疗效及预后提供初步的基础研究资料，有待进一步积累病例数，结合各种可能影响T细胞免疫功能的相关因素分析，获得更详尽的研究结果。

本课题组已建立了分别分析TCR V(3各亚家族na ve T细胞输出情况的方法[8],我们将进一步对移植后TCR各亚家族的TRECs水平分别进行定量检测，以期做出更系统更全面的免疫重建的评价。

【参考文献】
[1] Naylor K, Li G, Vallejo AN, et al. The in flue nee of age on T cell gen erati on and TCRdiversity[J]. J Immun ol, 2005, 174(11): 7446-7452.
[2] 李扬秋，韩素芳，杨力建，等.重度苯中毒患者胸腺输出近期功能明显低下[J].中国实验血液学杂志，2005, 13(1): 114-117.
[3] Li B, Li YQ, Yang LJ, et al. Decreased T cell
receptor excision DNA circles in peripheral blood mononuclear
cells among benzene exposed workers』.I nt J Immunogen et,
2009, 36(2): 107-111.
[4] 耿素霞，李扬秋，陈少华，等.慢性粒细胞白血病患者外周血初始T细胞水平和T细胞受体V B谱系利用特点[J].中华血液学杂
志,2005, 26(7): 413-416.
[5] Mitchell WA, Me ng I, Nicholso n SA, et al. Thymic output, ageing and zinc[J]. Biogerontology, 2006, 7(5-6):
461-470.
[6] Przybylski GK, Kreuzer KA, Siegert W, et al. No
recovery of T 烬cell receptor excision circles (TRECs) after
non :砥myeloablative alloge neic hematopoietic stem cell
tran spla ntatio n is correlated with the on set of GvHD[J]. J Appl Genet, 2007, 48(4): 397-404.
[7] Clave E, Rocha V, Talvensaari
K, et al. Prog no stic transplantation[J]. Blood, 2005, 105(6): 2608-2613.
value of pretra nspla ntati on host thymic fun cti on in
HLA 顺ide ntical sibli ng hematopoietic stem cell
DOC格式论文，方便您的复制修改删减
[8] 尹青松，李扬秋，陈少华，等.正常人外周血和脐血中TCR V(3亚家族sjTRECs的检测情况[J].细胞与分子免疫学杂志2006, 22(4): 477-479.ISSN1007-8738。