银杏黄酮类化合物提取分离和分析方法研究进展_罗兰

文章编号:1001-3717(2003)04-0255-03

银杏黄酮类化合物提取分离和分析方法研究进展*

罗兰,袁忠林

(莱阳农学院植保系,山东莱阳265200)

摘要:银杏黄酮类化合物具有较高的应用价值,是最有前途的药物之一,也是近年来研究的热点。本文综述了黄酮类化合物的提取、纯化及分析方法的研究近况。

关键词:银杏;黄酮;提取;分析;进展

中图分类号:Q946.8文献标识码:A

银杏(Ginkgo biloba L.)俗称白果、公孙树,是古生代二叠纪孑遗植物,被称为/活化石0。据5本草纲目6记载,银杏果具有敛肺平喘,止遗尿、白带作用。近年来,国内外学者对银杏的药用价值进行了很多研究。以银杏叶提取物制剂,对心脑血管、动脉硬化、高血压等疾病的治疗有价值且长期服用无毒副作用。银杏的化学成分较为复杂,现已从银杏叶中分离出大量的极性和非极性化合物,其中以黄酮类化合物、萜类内酯为主,另外还有有机酸、烷基酚和烷基酚酸、甾体化合物及微量元素等。银杏叶中提取的黄酮类和内酯类化合物具有很高的药用价值,广泛应用于人体捕获游离基、抑制血小板活化因子等。同时还用于保健品、化妆品等方面[1~3]。在农业方面,早就有银杏用于杀虫治病的记载。近年来,莱阳农学院孟昭礼教授以银杏中生物活性物质为先导化合物,仿生合成系列农用杀菌剂,开创了杀菌剂研究的新领域[4~6]。本文对银杏中黄酮类化合物提纯分离及分析技术作以综述,以期对其研究工作有所帮助。

1提取和分离

银杏黄酮类是低分子量化合物,均衍生于其母体化合物黄酮,以糖苷和甲基化的形式存在。已知银杏叶含黄酮类化合物35种,其中双黄酮6种,银杏黄酮苷元7种,黄酮苷17种。其成分复杂,为了提高纯度和收率,溶剂的选取是关键。

1.1水浸法

浸取的具体方法为:称取一定量的已烘干粉碎的银杏叶,加入水在一定的温度及pH条件下浸取。黄酮类化合物能与A1(NO3)3络合发生有色反应,以芦丁为标准物,用分光光度计在510nm处测定吸光度,计算浸取液中总黄酮的含量及浸出率[7]。

浸取的最佳条件:当银杏叶与水固液质量比为1B40,浸取温度为90e,浸取液pH值为8.0时,浸取12h,浸出率可高达91%。萃取方法是取一定量的银杏浸取液,加入乙基丁基酮溶剂萃取,当温度为60e,pH=3.0,萃取时间为30min时,分2次萃取率可达92%。黄酮化合物进入有机相,将有机相减压蒸馏,除去溶剂,再加入少量乙醇,将残留溶剂除去,得到银杏黄酮类化合物。

1.2有机溶剂的提取

将银杏叶阴干粉碎,置于提取罐中,用90%乙醇80e回流提取3次,每次1.5h,提取液合并后加入真空浓缩罐中,在60e下减压浓缩成浸膏。将此浸膏置于沉降槽中加水搅拌溶解,静置沉降3h,然后由上而下抽取上板框压滤机过滤,得到的滤饼重复水沉降操作。水沉降加水量为前两次银杏浸膏体积的3倍和2倍,第3次以后均为1倍。合并所有的水沉降过滤液,用盐酸调整pH=3~4值,按树脂重量的两倍计量取液,上树脂床进行吸附,待液流完后,分别用水和25%乙醇洗涤床层,然后用70%乙醇进行洗脱,洗脱液浓缩后采用喷雾干燥法干燥,条件为进口180e,出口80e。洗脱终点用薄层色谱法检查有无黄酮。用真空浓缩罐将洗脱液在60e 下减压浓缩回收乙醇后,进行干燥成粉。在此最佳

莱阳农学院学报20(4):258~260,2003

Jour nal of Laiyang A gr icultur al College

*收稿日期:2003-06-05

作者简介:罗兰(1965-),女,陕西咸阳人,西北农林科技大学在读博士研究生,高级实验师,现主要从事植物化学保护及仿生农药的研究工作。

工艺条件下产品质量稳定,符合德国标准,收率在1.2%~1.6%之间(以银杏叶干重计)[8]。

银杏叶中有效成分的提取常用酒精、水等溶剂,不同溶剂对银杏叶中有效成分的提取有较大影响。如酒精提取效率高,但成本也较高,且产品成分较杂,安全性也较低,甚至可能造成环境污染;水浸提法成本较低,但提取效率也低,因此,目前还采用其它方法进行提取纯化。

1.3超声波法

近年来,超声技术已应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆中毒质等研究。此方法具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。在较低温度超声作用下,对水浸提银杏叶中黄酮苷的工艺研究表明,超声可以强化水浸提法,达到省时、高效、节能的目的。

具体工艺为:银杏叶y剪碎(0.5cm)y按一定料液比加水浸润y超声处理y抽滤y定容y取样检测提取率。

在超声作用下的提取率明显高于无超声作用下的提取率,其值相差2.6倍左右,说明超声有强化水浸提法的作用。在35~55e范围内,黄酮提取率随温度的升高而升高。在料液比为1/30,超声处理时间55m in,温度50e的条件下效果最佳。超声波能够提高水浸提黄酮效率,其值等于常规水浸提效率的3倍左右,达到省时、高效、节能的目的。

1.4超临界流体萃取法

随着国际上超临界流体提取技术迅速发展,用该技术提取植物中的活性成分愈加广泛。与有机溶剂法相比,具有提取效率高、无溶剂残留、活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点,通过控制温度和压力以及调节改性剂的种类和用量,还可以实现选择性萃取和分离纯化。邓启焕[9]等以银杏叶有效成分分离为对象,建立了一套超临界流体小试、中试装置和实验方法,所得的提取物中银杏黄酮含量为28%,银杏内酯含量为7.2%,均高于国际现行公认的质量标准。据夏开元[10]报道,以乙醇和用大孔树脂提取的银杏叶精提物,于CO2-SFE精制前,毒性成分白果酸含量为2.0%,而用CO2-SFE 精提后,白果酸含量降低到0.02%。用超临界CO2提取银杏中的药用成分成为新热点之一。

1.5高速逆流色谱技术提取法

高速逆流色谱(high-speed counter current chromatography,H SCCC)技术是一种不用任何固定载体的液-液分配色谱技术,具有两大突出优点:¹因无使用载体而固有的吸附现象;º具有不同于一般色谱的分离方式,使其特别适用于制备性分离。用HSCCC技术提取分离银杏叶中黄酮苷及总内酯成分,已引起各国专家的重视。蔡定国等[11]报道了应用HSCCC技术,从银杏叶提取物中分离纯化得到3种主要苷元:槲皮素、山奈素、异鼠李素。

2纯化

吸附树脂提纯的报道很多,可用于纯化提取物的主要有聚苯乙烯、聚酰胺吸附树脂、活性炭、硅胶、大孔树脂以及硅藻土等。刘峥等[12]用聚酰胺树脂提纯银杏提取物(GBE),洗脱剂为95%乙醇,得到精制产物22.1%的黄酮,GBE收率为1.55%。肖顺昌等[13]报道了沸水提取银杏叶,树脂Dl01提纯后的GBE黄酮苷达到38%。南开大学生物系使用MDA型树脂提取银杏黄酮,用80%乙醇洗脱,可得纯度大于40%的黄酮(以芦丁为基准)。

由此可以看出,不同的树脂提纯的效果有很大的差别,主要是由于树脂的结构及性能、吸附液和洗脱剂等因素造成的。

采用吸附树脂精制GBE,不仅得到的GBE纯度高,产率高,而且产品安全,不存在重金属、有机溶剂毒性残留等问题,为提高银杏叶制剂质量开辟了一条高效、安全的途径,推动了银杏叶加工业由粗加工型向精加工型转化。何琦等[14],卢锦花等[15]证明大孔吸附树脂(D140和DM-130)吸附法对银杏黄酮的收率较高。因此寻找和合成对GBE选择性高、吸附容量大且易解吸的树脂,将为提高我国银杏叶产品在国内外市场的竞争力提供技术上的保证。3分析方法

3.1薄层色谱

李吉来等[16]用薄层色谱法进行了测定。其方法为:硅胶G薄层板,展开剂氯仿)苯)无水乙醇)冰乙酸)水(5.5B2B1B0.5B1),4~0e放置的下层溶液,上行展开后晾干,在可见光下观察,异鼠李素、山奈酚和槲素为黄色斑点;喷8%三氯化铝乙醇液后,3种甙元斑点呈鲜黄色;紫外光(365nm)下显黄绿色荧光,其Rf值分别为0.56、0.45和0.27。

3.2分光光度法

具体方法是:移取5ml提取液于25ml比色管中,加10ml30%乙醇,0.7ml NaNO3溶液、摇匀、放置5m in后加0.7ml A1(NO3);溶液摇匀、放置6m in 后加入1ml/L NaOH混匀,用30%乙醇稀释至刻

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