杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测 高效液相色谱法 编制说明

《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》国家标准编制说明
目录
1任务来源 (1)
2起草的目的意义 (1)
2.1企业产品质量控制的需要 (2)
2.2完善国家标准的需要 (2)
3京尼平苷酸研究、应用与标准现状 (3)
3.1京尼平苷酸研究 (3)
3.2京尼平苷酸开发应用 (3)
3.3京尼平苷酸标准 (3)
4主要起草过程 (4)
4.1成立标准制定工作组 (4)
4.2确定工作计划和标准制定原则 (4)
4.3查询国内外相关标准和文献资料 (4)
4.4 研究建立标准方法，开展条件实验 (5)
4.5方法验证 (6)
4.6形成标准讨论稿和编制说明 (7)
4.7形成标准草案 (7)
4.8形成标准征求意见稿和编制说明 (7)
4.9征求意见并形成标准送审稿和编制说明 (8)
5 本标准与国内外分析方法的关系 (8)
6主要技术指标依据与说明 (8)
6.1标准名称 (8)
6.2前言 (9)
6.3主体内容 (9)
6.4“范围”的界定 (9)
6.5原理 (9)
6.6仪器和设备 (9)
6.7试剂 (9)
6.8 京尼平苷酸HPLC定量检测方法 (10)
6.8.1样品处理 (10)
6.8.2检测条件 (10)
6.8.3 标准曲线 (12)
6.8.4 检出限和定量限 (12)
6.8.5 精密度 (13)
6.8.6 稳定性 (13)
6.8.7 重复性 (13)
6.8.8加标回收率 (14)
6.8.9小结 (15)
6.9 方法验证 (15)
6.9.1 参加验证的实验室 (15)
6.9.2 方法验证结果 (16)
6.10验证结论 (22)
7采用国际标准和国外先进标准程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况 (23)
8与现行法律法规和强制性标准的关系 (23)
9标准作为强制性或推荐性标准的意见 (23)
10实施标准的建议 (23)
1任务来源
本国家标准的制定任务是根据国家标准化管理委员会下达的国家标准制定计划《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》项目（计划号20193961-T-432）起草。

国家标准计划《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》由全国林化产品标准化技术委员会TC558归口上报及执行，主管部门为国家林业和草原局。

本标准由北京林业大学、中国标准化研究院、中国林业科学院林产化学工业研究所、南京林业大学、河北冠卓检测科技股份有限公司和无限极（中国）有限公司共同起草。

本标准主要起草人：雷建都、席兴军、刘静、王璐莹、王成章、黄超伯、兰韬、李文君、张敬轩、孙红梅。

2起草的目的意义
杜仲（学名Eucommia ulmoides Oliver），又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，为我国特有的珍贵木本药用植物，是我国珍稀濒危二级保护植物，传统以皮入药，有降压、止痛镇静、补肝肾、强筋骨和安胎等作用。

经过几十年来几代人的共同努力，我国杜仲产业从育种到种植模式乃至产业链的开发已经发生了历史性的飞跃。

在育种和栽培模式方面，我国已成功选育出一批适应性强，产胶量高的新品种，并总结出一整套行之有效的杜仲栽培模式，为我国大规模营造杜仲橡胶林奠定了很好的技术基础。

在产业化方面，杜仲胶及杜仲植物活性成分提取技术已经基本成熟、杜仲中药、杜仲保健品、食品、杜仲饲料的开发应用等综合利用体系已经基本形成，告别了几千年来仅靠杜仲树皮药用的历史。

杜仲的叶、花、果等也具有很高的食用和药用价值。

杜仲叶因其化学成分、药效与杜仲皮相似而代皮入药，研究表明杜仲叶中含京尼平苷酸、京尼平苷、绿原酸等活性成分。

这些活性成分，在降血脂、降血压、促进睡眠、防辐射和防突变、预防骨质疏松和抗衰老、预防心肌梗死和脑梗死、保护视力、增强智力、抑制过敏反应、抗菌消炎、抑制癌细胞发生和转移等多方面具有显著功效、是开发现代中药、保健品、功能食品等的优良原料，已经被列入国家新食品原料目录。

《中华人民共和国药典》2005年版(一部)开始收载杜仲叶。

京尼平苷酸亦名京尼平甙酸、栀子苷酸或栀子甙酸，是一种环烯醚萜葡萄糖苷，广泛存在于植物组织细胞中，如杜仲科杜仲属植物杜仲的皮、叶和雄花。

近年来，人们已经证明京尼平苷酸具有增强记忆、抗氧化、降压、抗应激作用、消炎利胆等生物活性。

如今，大部分杜仲叶提取物厂家以京尼平苷酸含量作为质量检测的关键成分之一，京尼平苷酸含量水平是杜仲叶及其提取物的重要质量指标之一。

2.1企业产品质量控制的需要
目前，市面上生产杜仲叶提取物及京尼平苷酸的厂家有30多家（如成都普菲德生物技术有限公司、武汉远成共创科技有限公司、西安斯诺特生物技术有限公司、南京道斯夫生物科技有限公司、上海联迈生物工程有限公司、南京复苏生物科技有限公司、湖北江民泰华化工有限公司、兰州沃特莱斯生物科技有限公司、河南白云牧港生物科技有限公司、湖南长沙上禾生物科技有限公司、陕西浩洋生物科技有限公司、四川轩禾康生物科技有限公司等），还有数十家以杜仲叶提取物为原料的食品、药品、化妆品生产企业（如无限极有限公司、萍乡武功山休闲旅游有限责任公司等）。

我国目前杜仲栽培面积约500万亩，杜仲种植比较集中的地区是贵州、湖南、四川、湖北、陕西、河南、重庆、甘肃、安徽、江西等省、市和地区，江苏、广西、云南、山西、山东、河北、北京、新疆等多个省份也都引种成功。

每年产生上千万吨杜仲叶，大部分被浪费掉或作为低值饲料应用。

目前，以杜仲叶为原料生产杜仲叶提取物、保健食品、饮料、化妆品、复方药品的规模不断扩大。

但是，杜仲叶重要标志成分京尼平苷酸含量测定尚无国家标准，因此，本标准的制定是企业进行产品质量控制的需要。

2.2完善国家标准的需要
我国现行检测方法标准中，尚无京尼平苷酸检测方法标准。

为了贯彻落实《中共中央、国务院关于深入推进农业供给侧结构性改革加快培育农业农村发展新动能的若干意见》（文件精神，科学指导杜仲叶及其提取物生产、加工产业的发展，急需制定《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》国家标准，建立杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量检测标准，为杜仲叶提取物及相关产品的质量控制提供方法，为杜仲叶提取物、京尼平苷酸产品研发及杜仲综合开发利用提供
依据，进而引导生产，规范市场。

所以，本标准的制定也是完善杜仲叶等药食两用原料与中药材及其加工产品检测方法国家标准的需要。

3京尼平苷酸研究、应用与标准现状
3.1京尼平苷酸研究
国内外对京尼平苷酸的研究十分广泛，可查询到大量的论文与专利，研究范围包括提取分离、纯品制备、分析检测、结构表征、药理活性、毒性、分子结构改性、产品加工等方面。

3.2京尼平苷酸开发应用
以京尼平苷酸为活性成分的加工产品有杜仲叶提取物、复方中成药等。

海联迈生物工程有限公司、南京复苏生物科技有限公司、湖北江民泰华化工有限公司、兰州沃特莱斯生物科技有限公司、成都德思特生物技术有限公司、四川省维克奇生物科技有限公司、成都格利普生物科技有限公司、上海纯优生物科技有限公司、湖北齐飞医药化工有限公司、上海烜雅生物科技有限公司、湖北实顺生物科技有限公司、南京道斯夫生物科技有限公司、上海源叶生物科技有限公司、合肥四峰生物科技有限公司、安徽致峰生物科技有限公司等众多公司生产杜仲叶提取物或京尼平苷酸。

总的说来，杜仲叶提取物及活性成分京尼平苷酸的开发利用尚处于初级发展阶段，虽然有提取物粉末、复方中成药等几种类型的产品，但还需进一步扩大规模化和深入研究。

3.3京尼平苷酸标准
未查到与京尼平苷酸相关的国家标准、行业标准、地方标准和企业标准。

京尼平苷酸分析方法标准的缺失，使得相关企业在市场竞争中无标准可用，相关产品缺乏技术支撑，质量参差不齐。

因此，有必要尽快制定《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》国家标准，以满足相关企业和检测、管理结构的需要。

4主要起草过程
4.1成立标准制定工作组
国家重点研发项目立项后，2017年11月10日在北京市西藏大厦召开了国家标准《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》第一次工作会。

参加单位有北京林业大学、中国标准化研究院、南京林业大学等。

会议成立了由北京林业大学、中国标准化研究院、中国林业科学院南京林产化学工业研究所、南京林业大学等单位参加的标准工作组，主要由从事标准制修订、仪器分析、具有丰富技术经验的专业研究人员组成，工作组制定了初步的标准编制工作计划。

4.2确定工作计划和标准制定原则
按照工作任务要求，工作组制定了标准起草工作计划和任务分工。

在充分研究与讨论的基础上，制定了标准制定原则：
（1）先进性：其准确度、精密度和灵敏度达到较高水平。

（2）适用性：要适应我国农林植物加工产业发展的要求。

（3）可操作性：符合我国目前检测仪器设备和试剂、材料的供应条件。

（4）实用性：符合检测从业人员的技术水平，能被国内主要的农林活性成分质量监督分析实验室所使用并达到所规定的要求。

要有利于提高杜仲叶、杜仲叶提取物及其制品质量，为医药、食品、化妆品等质量控制部门、有关企业和三农服务。

4.3查询国内外相关标准和文献资料
2017年，开始开展“杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法”方法研究。

由于在现行国家标准、行业标准、地方标准、团体标准和企业标准中，均无相应的检测方法标准，所以我们查阅相关文献并开展研究工作。

对于杜仲叶提取物活性成分的检测，采用检测方法不统一，有的通过紫外可见光光度法检测总黄酮含量，误差大；有的则仅检测绿原酸单一组分，难以准确控制提取物的质量，也有个别文献报道采用HPLC检测其中多个组分，但检测方法还需要进一步改进、验证和完善。

京尼平苷酸是杜仲叶及提取物中重要活性成分之一，目前，关于杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测方法缺乏统一的国家标准，国外ISO\AOAC也无相关检测标准。

因此，有必要对杜仲叶提取物中京尼平苷酸的
含量测定建立统一可靠的方法，并形成国家标准。

尼平苷酸的检测主要有两种方法：分光光度计检测法和高效液相色谱法。

杜仲提取物中含有大量的环烯醚萜类物质，高效液相色谱法能够迅速、灵敏地将其分离，显示了高于传统分光光度计的优越性，而且准确度高，是目前很多天然产物检测的重要方式之一。

借鉴文献方法，以杜仲叶及其提取物为样品，经过初步试验，证明方法是可行的。

而后对方法进行优化，对方法进行验证，结果表明方法的准确性、回收率、精密度等方面都能达到国家标准的要求，并且基本符合制定国家标准的条件，并于2018年向国家标准化管理委员会提出立项申请。

4.4 研究建立标准方法，开展条件实验
标准工作组按照计划任务书的要求，结合制定标准的要求，研究建立标准方法的实验方案，并进行方法前处理条件的选择、仪器条件的确定和方法精密度、准确度及检出限的测定等试验。

2017年11月始，标准起草工作组赴杜仲叶产地进行调研，获取了大量相关信息与数据。

2017年11月从河南、山东、陕西、四川、湖北、湖南、江西、贵州等地采集了22份杜仲叶样品（表1）。

另外，购买了市场上的杜仲叶提取物20份，见表2.
表1 杜仲叶样品列表（1）
表2杜仲叶提取物样品列表
将杜仲叶样品用采用溶剂提取得到杜仲叶提取物，然后与购买得到的杜仲叶提取物都作为检测试样，开始开展实验室验证工作，建立京尼平苷酸高效液相色谱分析方法，包括线性范围、相关系数、加标回收率、准确度、精密度、检出限、定量限等；样品中京尼平苷酸提取条件的摸索与优化，如提取溶剂体积、提取时间等。

4.5方法验证
2019年6～7月，由5家单位对“杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液
相色谱法”进行验证，分别是中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室、北京化工大学理学院、中国计量大学生命科学学院、河北冠卓检测科技股份有限公司、南京林业大学，通过统计检验技术确认外部实验室试验结果的准确性。

4.6形成标准讨论稿和编制说明
2019年7月5日，起草工作组组织相关单位和专家，在山东青岛中国科学院兰州化学物理研究所召开第二次标准起草工作会。

参会单位包括北京林业大学、中国标准化研究院、中国林业科学院南京林产化学工业研究所、南京林业大学、中国科学院兰州化学物理研究所、北京化工大学等。

与会专家对《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》标准草案中的英文名称、范围、术语和定义、基本要求、主要技术指标、附录等章条提出了详细的意见，会后根据修改意见形成了《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》标准讨论稿及其编制说明。

4.7形成标准草案
标准起草工作组查阅、收集和整理了国内外有关研究进展和专利、标准、法规等文献资料，掌握了相关标准的现状；对文献中京尼平苷酸测定方法进行了对比和总结，为标准文本的编制奠定理论基础。

在《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》国家标准第一次起草工作会议的基础上，起草工作组相关单位共同讨论起草形成了《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》国家标准的技术框架和主要内容，初步形成了《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》标准草案。

4.8形成标准征求意见稿和编制说明
在前期工作的基础上，起草工作组组织相关单位和专家于2019年10月22日在北京中国标准化研究院召开第三次标准起草工作会。

参会单位包括北京林业大学、中国标准化研究院、北京化工大学、中国科学院兰州化学物理研究所、中国林业科学研究院南京林产化学工业研究所等。

与会成员认真讨论《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》标准讨论稿后，根据讨论结果修改形成了《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》征求意见稿及编制说明。

会议同时讨论了下一阶段征求意见的单位和专家名单。

4.9征求意见并形成标准送审稿和编制说明
2020年月日-2020年月日，起草工作组根据讨论的专家和单位名单，分别向相关的行业主管部门、科研机构、检测部门和企业等20个单位和专家发出了标准征求意见稿，向相关单位和专家征求标准修改意见。

截止到2020年月日，共收集到、…等25家科研机构、检测机构、管理部门、生产企业等单位提出的反馈意见40条。

起草工作组对提出的意见经过反复研究、讨论和处理后，修改形成了《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》送审稿及编制说明。

具体意见汇总和处理表见《杜仲叶提取物中京尼平苷酸的检测高效液相色谱法》征求意见稿及编制说明。

国家标准征求意见汇总处理表。

5 本标准与国内外分析方法的关系
本标准研究旨在建立一项满足我国药食两用原料杜仲叶及其提取物中京尼平苷酸含量检测要求，在质量控制目标和技术手段上与国际接轨，适应我国大部分农林植物有效成分质控实验室仪器设备和技术能力的检测方法标准。

通过查阅国内外相关文献资料，制定条件优化方案，确保本方法前处理所采用的装置操作简便，能够满足国内实验室的条件要求。

本标准拟采用高效液相色谱-紫外检测分析方法（HPLC-UV）测定京尼平苷酸。

检测方法参考文献资料，通过紫外光谱知道，京尼平苷酸最大吸收波长为240 nm，确定其检测波长为254 nm。

采用京尼平苷酸对照品外标法直接定量。

选择合适的色谱柱以及仪器条件。

力求方法在稳定、可靠和实用的基础上，达到国际先进水平，以适应我国特种经济林杜仲叶及其提取物中京尼平苷酸含量检测、质控与管理的需要。

6主要技术指标依据与说明
6.1标准名称
本标准主要解决杜仲叶提取物中京尼平苷酸测定的技术问题，所以将本标准的名称定为：《杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量检测高效液相色谱法》。

本标准名称中杜仲一词的英文，根据相关国家标准的翻译方式、行业内的通行用法确定为“Eucommia ulmoides oliver”。

因此将本标准的全称杜仲叶提取物中京尼平苷
酸含量检测高效液相色谱法》翻译为“Determination of Geniposidic acid in Eucommia ulmoides oliver Leaf Extracts by HPLC”。

6.2前言
明确了本标准的归口单位及主要起草单位、起草人。

6.3主体内容
标准的主体内容包括：范围、规范性引用文件、原理、仪器和设备、试剂和材料、检测方法、分析结果计算、回收率和精密度、允许差和稳定性、检验报告等。

6.4“范围”的界定
本标准规定了用高效液相色谱测定杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量的原理、材料、仪器与设备、测定步骤、结果计算与表示、精密度和回收率、检验报告。

本标准规定了杜仲叶提取物中京尼平苷酸的高效液相色谱（HPLC）检测方法。

6.5原理
对京尼平苷酸在90 ~ 400 nm进行紫外吸收光谱扫描，测定其最大紫外吸收波长为240 nm，因此可以采用高效液相色谱紫外检测的方法进行测定，确定检测波长为240 nm。

用京尼平苷酸对照品外标法直接定量。

6.6仪器和设备
6.6.1 分析天平：灵敏度0.0001g。

6.6.2 离心机：转速≥5000rpm。

6.6.3 高效液相色谱仪：包含梯度洗脱、紫外检测器及色谱工作站。

6.7试剂
6.7.1 除非另有说明，在分析中所使用试剂均为分析纯，用水为GB/T 6682规定的三级水。

6.7.2甲醇：色谱纯。

6.7.3磷酸：优级纯。

6.7.4京尼平苷酸标准品：纯度≥98%。

6.7.5标准品储备溶液（2.0 mg/mL）：分别称取200mg京尼平苷酸标准品（6.7.4），
精确至0.001 g，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，混匀。

6.7.6系列标准工作溶液：分别准确移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、6.0 mL、10 .0mL京尼平苷酸标准储备溶液（6.7.5）于不同的10mL容量瓶中，用甲醇（6.7.2）稀释并定容至刻度，摇匀，得到京尼平苷酸系列标准工作溶液。

6.7.7 0.45 μm有机相滤膜。

6.8 京尼平苷酸HPLC定量检测方法
6.8.1样品处理
称取杜仲叶提取物样品50 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量、超声溶解、定容至刻度，摇匀，用0.45 μm有机相滤膜微滤，然后进行HPLC分析。

6.8.2检测条件
按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪。

以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性：
色谱条件如下：
色谱柱：RP-C18（粒径5 μm，250 mm×4.6 mm）；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30℃±0.5℃；
进样量：10 μL；
检测波长：240 nm；
流动相：A.甲醇; B. 0.1%磷酸水溶液；梯度洗脱条件见表3。

表3 梯度洗脱条件
色谱图见图1，A 为标准品，B 为提取物的色谱图
510152025
0200000
400000600000800000100000012000001400000
10
20
30
40
50
0100000
2000003000004000005000006000007000001
图1 杜仲叶提取物中京尼平苷酸的色谱检测图
A
B
6.8.3 标准曲线
图2、京尼平苷酸检测标准曲线
由图2可知京尼平苷酸标准溶液峰面积和浓度在0.005 mg/mL ~ 1.2 mg/mL 之间线性关系良好，经线性拟合可得京尼平苷酸标准曲线为：
y=2×107x+5.65×105
相关系数：R2=0.9994
6.8.4 检出限和定量限
定量限是指样品中被检测物能被定量检测到的最低量，其测定结果应具有一定的准确度。

定量限表现的是某一分析方法是否具备敏捷的定额检测能力。

液相色谱法中规定检测器产生的响应信号为噪声值十倍，即信噪比S/N=10时的量为定量限。

在京尼平苷酸标准品检测中，发现当京尼平苷酸标准品溶液为
0.0001mg/mL时，检测器产生的响应信号是噪声值的十倍，即信噪比S/N=10，所以定量限为0.0001mg/mL。

检测限是指一种分析方法在给定的可靠程度内可从样品中检测到待测物质的最小浓度或者最小量。

高效液相色谱法中规定检测限为物质引起检测器产生的响应信号是噪声值的三倍时，即信噪比为S/N=3时的量。

将定量限检测用的样品，稀释3.3倍。

取100μL定量限检测所用样品，加入230μL去离子水，得到330μL稀释后的样品，进行液相检测。

检测结果表明，检测器产生的响应信号约
为噪声值的三倍，即信噪比S/N=3，此时京尼平苷酸浓度为0.03 μg/mL 。

6.8.5 精密度
精密度指的就是当对多个量进行多次测量时，各个量测结果之间的离散程度。

要求所加工的零件的尺寸达到的准确程度,也就是容许误差的大小，容许误差大的精密度低，容许误差小的精密度高，简称“精度”,常用相对标准偏差(relative standard deviation ，RSD)表示。

相对标准偏差的计算公式如下：
%100⨯=
x s
RSD
其中S 为标准偏差(也可以表示为SD)。

实验相对标准误差为1.16%，实验偏差较小，精密度符合要求。

表 4 精密度实验结果（n=6）
试验号 1
2
3
4
5
6
RSD% 峰面积 15218938 15708573 15363725 15665750 15414544 15376852 浓度 0.8000
0.8267
0.8079
0.8243
0.8106
0.8086
1.16
6.8.6 稳定性
配制浓度为0.25 mg/mL 的京尼平苷酸溶液，按6.8.2色谱条件进行检测，得到其峰面积，如此反复每隔1 h 进样1次，共进样5次，计算5次峰面积的相对标准偏差（即RSD 值），5次重复进样的相对标准偏差为1.77%，测定稳定性良好。

6.8.7 重复性
配制浓度为五份0.3 mg/mL 的京尼平苷酸溶液，按6.8.2色谱条件进行检测，分别得到其峰面积，计算其RSD 值，具体实验结果如表5所示，其RSD 值为1.62%，误差小于规定的2%，由此判断其重复性良好，实验方案可行，实验人
员的操作相对规范。

表 5 重复性实验结果（n=6）
试验号 1 2 3 4 5 6 RSD% 浓度mg/mL 0.203 0.205 0.198 0.204 0.205 0.197 1.62 6.8.8加标回收率
本研究同时也采用了杜仲叶提取物进行加标回收率的测定，以检测该法对含有不同杂质的京尼平苷酸的检测精度，以京尼平苷酸浓度为0.021 mg/mL的杜仲叶提取物为本底进行加标，京尼平苷酸标准品添加量分别为0.01 mg/mL（定量限）、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL。

按照6.8.2的色谱条件进行检测，其具体结果如表6所示。

其低浓度加标平均回收率为104.17%、中浓度加标回收率为105.83%、高浓度加标回收率为93.83%，其回收率均满足要求。

6.8.9小结
上述结果表明，高效液相色谱法测定杜仲叶提取物中京尼平苷酸，实验室内方法检出限为0.03 μg/mL，定量限为0.0001 mg/mL。

对杜仲叶提取物实际样品进行加标回收实验，回收率在90% ~ 110%之间，相对标准偏差为2.92% ~ 4.82%，说明方法的精密度和准确度良好。

综上所述，本标准方法能够满足杜仲叶提取物中京尼平苷酸含量测定要求。

6.9 方法验证
6.9.1 参加验证的实验室
选择5 家具有资质的实验室参加方法的验证工作（表7）。

向验证单位提供方法草案、验证方案、标准溶液和验证报告格式。

验证单位按照方法草案准备实验用品，在规定时间内完成验证实验并反馈验证结果报告。

在方法验证前，参加验证的操作人员应熟悉和掌握方法原理、操作步骤及流程。

方法验证过程中所用的试剂和材料、仪器和设备及分析步骤应符合方法相关要求。