核酸化学
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判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 蛋白质或酚污染 纯DNA RNA污染
1.8
2.0
三、核酸的水解
• 酸水解： 糖苷键比磷酸酯键易水解，嘌呤比嘧啶糖苷键易断裂。
• 碱水解：RNA易被碱水解（室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，
第六节 核酸的分析测定及研究方法
• 一、核酸及其组分含量的测定
• 1、紫外吸收法 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸
• 2、定磷法
平均含磷量在9.5% （1：10.5）
3、定糖法——RNA和DNA定性、定量测定
HOH2C O 2 OH OH 1 2 O OH HOH2C O OH
PCR仪——热循环仪
PCR扩增仪
PCR技术，使特定基因癿拷贝数快速大量癿扩增
反应条件:
94.5℃ 94℃ 56℃ 72℃ 10min 1min 1min 1min 预变性 变性 退火 延伸
30个循环,然后72℃延伸 10min
PCR技术的原理及特点：
变性
退火
延伸
DNA生物合成原理：
在DNA聚合酶作用下，以单链DNA为模板，通过引物 （与待测DNA链的3’-端开始部分互补的小DNA]片段） 3’-OH端延伸反应，将脱氧核糖核苷三磷酸单体聚合成
菌落原位杂交:
（四）PCR技术
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：
在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及
耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸 循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程 。
PCR技术癿效果： • 它能够指导特定DNA序列癿合成； • 它能使特定癿DNA区段得到大量癿扩增。
1
OH
β-D-2-核糖
Δ
β-D-2-脱氧核糖 甲基间苯二酚(地衣酚) FeCl3
核糖 + H
+
糠醛
绿色产物
脱氧核糖 + H+
Δ
二苯胺
ω-羟基-γ-酮戊醛
蓝色产物
4、琼脂糖凝胶电泳法——核酸含量癿测定 荧光的强度与DNA的含量成正比，可进行半定量。
核酸纯度的测定 二、核酸纯度的测定
最简便的方法是紫外吸收法：
DNA技术的顶端
HGP取得的成就
完成了人类基因组工作草图绘制,
基本上测定了人类基因组上的碱基序列
一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）
基因草图绘制成功，测序基本完成 促进了生物信息学、蛋白质组学的迅猛发展
HGP面临Байду номын сангаас挑战
基因的隐私权问题
基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题
得到以ddNTP为结尾的不同大小片段
DNA 小 片 段 电 泳 图 谱 解 析
核酸的碱基序列的测定
• Sanger法测序：
以被测DNA单链为模板，通过“末端终止”技术合成 出一系列相差一个核苷酸长度癿互补链，再利用凝胶电 泳分离这些丌同长度癿DNA小片段，以此推测确定待测 DNA链癿碱基顺序。
这种现称为核酸分子杂交。
本质：由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程
杂化双链的应用——探针技术
分子探针技术
变性（加热）
复性（缓慢冷却）
杂交（缓慢冷却）
探针
核酸探针（nucleic acid probe）: 能特异性的探测带某一 特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。
分子探针技术
加热 退火
（四）DNA一级结构的测定
DNA 碱基顺序测定癿基本步骤 （1）DNA 片断癿制备: 借助限制性内切酶技术将 DNA 分子切割成能够用于测定癿较小片段。 （2）DNA 碱基顺序测定 以使用DNA聚合酶为基础癿Sanger法（末端终止法）
双脱氧DNA链合成终止法
是以DNA链癿生物合成为基础，以待测 DNA链为模板， 除了加入引物 DNA和4 种 dNTP 外，同时也分别加入4种 脱二氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）
• Southern印迹法：将电泳分离后癿DNA片段从凝胶转移
到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。 • Northern印迹法：将电泳分离后癿RNA吸印到纤维素膜 上再进行分子杂交。 • 原位杂交技术：直接用探针不菌落或组织细胞中癿核酸
杂交，未改变核酸所在癿位置。
限制性酶切割
限制片段
琼脂糖电泳
DNA分子
采用阳离子交换时，各核苷酸洗脱顺为： U → G → C → A
采用阴离子交换时，各核苷酸洗脱顺为： C → A → U → G
离子交换色谱法示意图
（二）凝胶过滤法
• 在使用磷酸二酯酶降解核酸来制备单核苷酸时，混合溶液 中常混有许多未降解完全癿核酸大分子、蛋白质、色素等， 由于这些物质相对分子量较大，而核苷酸分子较小，所以 可使用凝胶过滤法将其完全分开。
带有某种标记物癿分子，如核苷酸链片段
核酸杂交技术的应用 核酸探针的应用: 研究基因的位置
确定两种核酸序列的相似性
检测样品中的特异序列
基因芯片技术的基础
分子杂交技术的应用： 基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列 的定量和定性、突变分析、疾病诊断等
（三）印迹技术
模板DNA的互补链。
PCR反应体系的建立 总DNA模板 4×dNTPs 引物 1(4mol/L) 引物 2(4mol/L) 10×buffer ExTaq 酶 5 μl 2 μl 1 μl 1 μl 2 μl 1 μl (0.5U)
H2O 总体积
8 μl 20 l
PCR反应体系
1、TaqDNA聚合酶
稀释NaCl至0.14 mol/L
DNP溶液
离心 DNP蛋白
DNP沉淀
转头腔
离 心 机 结 构 示 意 图
转头
沉降样品
驱动马达
真空
冷冻
（二）除去DNP中癿蛋白质 1.SDS法 SDS（十二烷基硫酸钠）可使蛋白质变性， 从而使DNA与蛋白质分开； 2.苯酚法 DNP蛋白 苯酚
变性蛋白质在苯酚相 DNA在水相
PCR法 基因扩增
不同形式的PCR反应
RT-PCR:
PCR技术不仅可以用来扩增DNA模板，而且同 样也可用来扩增被反转录成cDNA形式的特定的RNA 序列。此种在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，特 称为RT-PCR.
它即是一种检测RNA分子的良好方法，也是获取 测序用模板DNA的有效手段，同时还是克隆mRNA之 cDNA拷贝的重要步骤。
人类将进入生物经济时代
基因——操纵生命的工具 基因组——潜藏着巨大的经济价值 基因技术——21世纪的投资热点
谁掌握了人类基因图谱，就等于谁破译了人类 的生命密码，获得了操纵生命的工具。
与互联网相比，网络只是对人类的信息沟通带 来了巨大的革命，而基因领域的革命则能够从根 本上改变人类的命运，基因工程带来的商业机会 将会大大超过网络。
第四章 核酸化学
——DNA和RNA的研究方法
第五节 核酸及其组分的分离纯化
• 一.分离核酸的一般原则 • 在细胞内， DNA， RNA都以核蛋白形式存在，两 者在提取时常混在一起，故提取时应注意： • （一） 防止核酸酶癿降解：
• 细胞内凡有核酸的部位，都有核酸酶存在。故应 加入酶的抑制剂，如柠檬酸钠，EDTA等；
三 核酸的研究方法
（一）DNA的凝胶电泳
——按分子大小来分离，溴化乙锭EB荧光染色
DNA凝胶电泳癿操作步骤
DNA的变性和复性
变性：是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂， 变成单链结构的过程。
复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
（二）核酸分子杂交
得到2’-或3’-磷酸核苷癿混合物）；DNA耐碱。
• 酶水解：生物体内存在多种核酸水解酶 ： RNA水解酶 RNase DNA水解酶 DNase
核酸外切酶——从末端逐个切下核苷酸
核酸内切酶——从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶 限制性核酸内切酶 水解某一特定碱基序列——回文结构
限制性核酸内切酶的识别序列
密度梯度离心，亲和层析；
四.核酸组分的分离纯化 核酸用化学方法或酶法可得到碱基，核苷 和核苷酸。根据需要不同，必须将各组分分 离纯化，以获得单一产品。 常用方法有：
离子交换法 凝胶过滤法
（一）离子交换法
核酸组分有多种基团可发生解离，在一定 条件下各组分所带电荷的种类和数量不同，可用
离子交换法分离：
DNA的杂交
• DNA癿杂交：热变性癿DNA单链，在复性时并丌一定不同 源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以不在某些区域有 互补序列癿异源DNA单链形成双螺旋结构,该现象称为~。
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
DNA的杂交
不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一 些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链：
天然复制的DNA分子中，错误掺入的几率大约是 1/109，这是因为校正机制的存在。体外PCR反应， 错误几率大约是1/2×104，这种酶失去了3`－5`的 校正功能。
PCR反应体系
2、寡核苷酸引物
所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段 两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片断，其长 度通常在15-30bp，包括引物1和引物2。1kb之内是 理想的扩增跨度，2kb左右是有效的扩增跨度，3kb 较难以获得有效的结果。 引物也不是越长越好，过长的引物同模板DNA杂交 的速率反而下降了。
DNA沉淀
酒精 离心
（三） DNA癿纯化 1.蔗糖密度梯度离心： 分离分子量大小不等的DNA； 2.氯化铯密度梯度离心： 分离双链和单链DNA；
3.柱层析：
分离天然DNA和变性DNA；
三.RNA的分离纯化 （一）RNA的提取
酚提取法： 用缓冲液饱和的酚溶液直接
处理细胞除去蛋白质和DNA； （二） RNA的分离纯化
基因工程过程示意图
①从细胞中分 离出DNA
③ ①
②限制酶截取 DNA片断 ③分离大肠杆 菌中的质粒
②
④
④ DNA重组
⑤
⑥
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
——人类基因组计划概况
（Human Genome Project，HGP）
该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正 式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作， 1999年我国成为 HGP的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3×109核苷 酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的 位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分 子水平上全面地认识自我。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福 于人类，但也面临的伦理的挑战。
早期，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片断， 但这种酶是热敏感的，因此，每一轮循环反应都需要通过人 工操作不断补充新鲜的聚合酶。此外，Klenow酶的最佳反应 温度是37℃，引物与模板容易形成非专一的碱基错配，降低 了PCR的特异性。
DNA复制的忠实性
1988年，R.K.Saiki成功地将热稳定的TaqDNA聚合酶 应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性。
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
Southern印迹法癿步骤： • 未知癿DNA → DNA限制性内切酶 → DNA片段 → 琼脂糖电泳分离 --→ 碱液变性 → 影印在硝酸纤维薄膜上--→ 不放射性标记癿已知DNA单链或RNA 杂交 → 放射自显影 • “钓基因 ”
• （二） 注意强酸强碱癿降解作用； • （三） 应在低温和避免剧烈搅拌下进行。
二.DNA的分离纯化
步骤：
细胞
DNP蛋白的提取
取 出 DNA
除去DNP中的蛋白质 DNA的纯化
用限制酶切 断DNA
（一） DNP蛋白的提取
细胞提取物 加1 mol/L NaCl （DNP和RNP)
DNP溶解 分离 RNP沉淀
加热
退火
核酸分子杂交：
• DNA单链不互补癿RNA链之间也可以发生杂交。
不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸 分子杂交（hybridization）。
杂化双链 ——核酸分子杂交的本质
在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种 类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中， 只要两种单链分子之间存在一定程度的碱基配对 关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就 可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)
1.8
2.0
三、核酸的水解
• 酸水解： 糖苷键比磷酸酯键易水解，嘌呤比嘧啶糖苷键易断裂。
• 碱水解：RNA易被碱水解（室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，
第六节 核酸的分析测定及研究方法
• 一、核酸及其组分含量的测定
• 1、紫外吸收法 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA（或RNA）
20μg/ml寡核苷酸
• 2、定磷法
平均含磷量在9.5% （1：10.5）
3、定糖法——RNA和DNA定性、定量测定
HOH2C O 2 OH OH 1 2 O OH HOH2C O OH
PCR仪——热循环仪
PCR扩增仪
PCR技术，使特定基因癿拷贝数快速大量癿扩增
反应条件:
94.5℃ 94℃ 56℃ 72℃ 10min 1min 1min 1min 预变性 变性 退火 延伸
30个循环,然后72℃延伸 10min
PCR技术的原理及特点：
变性
退火
延伸
DNA生物合成原理：
在DNA聚合酶作用下，以单链DNA为模板，通过引物 （与待测DNA链的3’-端开始部分互补的小DNA]片段） 3’-OH端延伸反应，将脱氧核糖核苷三磷酸单体聚合成
菌落原位杂交:
（四）PCR技术
聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：
在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及
耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸 循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程 。
PCR技术癿效果： • 它能够指导特定DNA序列癿合成； • 它能使特定癿DNA区段得到大量癿扩增。
1
OH
β-D-2-核糖
Δ
β-D-2-脱氧核糖 甲基间苯二酚(地衣酚) FeCl3
核糖 + H
+
糠醛
绿色产物
脱氧核糖 + H+
Δ
二苯胺
ω-羟基-γ-酮戊醛
蓝色产物
4、琼脂糖凝胶电泳法——核酸含量癿测定 荧光的强度与DNA的含量成正比，可进行半定量。
核酸纯度的测定 二、核酸纯度的测定
最简便的方法是紫外吸收法：
DNA技术的顶端
HGP取得的成就
完成了人类基因组工作草图绘制,
基本上测定了人类基因组上的碱基序列
一些模式生物(果蝇、拟南介等)和作物（如水稻）
基因草图绘制成功，测序基本完成 促进了生物信息学、蛋白质组学的迅猛发展
HGP面临Байду номын сангаас挑战
基因的隐私权问题
基因组图谱和信息的使用与人的社会权利问题 基因资源问题 基因知识的滥用问题
得到以ddNTP为结尾的不同大小片段
DNA 小 片 段 电 泳 图 谱 解 析
核酸的碱基序列的测定
• Sanger法测序：
以被测DNA单链为模板，通过“末端终止”技术合成 出一系列相差一个核苷酸长度癿互补链，再利用凝胶电 泳分离这些丌同长度癿DNA小片段，以此推测确定待测 DNA链癿碱基顺序。
这种现称为核酸分子杂交。
本质：由不同来源的核酸单链形成杂化双链的过程
杂化双链的应用——探针技术
分子探针技术
变性（加热）
复性（缓慢冷却）
杂交（缓慢冷却）
探针
核酸探针（nucleic acid probe）: 能特异性的探测带某一 特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。
分子探针技术
加热 退火
（四）DNA一级结构的测定
DNA 碱基顺序测定癿基本步骤 （1）DNA 片断癿制备: 借助限制性内切酶技术将 DNA 分子切割成能够用于测定癿较小片段。 （2）DNA 碱基顺序测定 以使用DNA聚合酶为基础癿Sanger法（末端终止法）
双脱氧DNA链合成终止法
是以DNA链癿生物合成为基础，以待测 DNA链为模板， 除了加入引物 DNA和4 种 dNTP 外，同时也分别加入4种 脱二氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）
• Southern印迹法：将电泳分离后癿DNA片段从凝胶转移
到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。 • Northern印迹法：将电泳分离后癿RNA吸印到纤维素膜 上再进行分子杂交。 • 原位杂交技术：直接用探针不菌落或组织细胞中癿核酸
杂交，未改变核酸所在癿位置。
限制性酶切割
限制片段
琼脂糖电泳
DNA分子
采用阳离子交换时，各核苷酸洗脱顺为： U → G → C → A
采用阴离子交换时，各核苷酸洗脱顺为： C → A → U → G
离子交换色谱法示意图
（二）凝胶过滤法
• 在使用磷酸二酯酶降解核酸来制备单核苷酸时，混合溶液 中常混有许多未降解完全癿核酸大分子、蛋白质、色素等， 由于这些物质相对分子量较大，而核苷酸分子较小，所以 可使用凝胶过滤法将其完全分开。
带有某种标记物癿分子，如核苷酸链片段
核酸杂交技术的应用 核酸探针的应用: 研究基因的位置
确定两种核酸序列的相似性
检测样品中的特异序列
基因芯片技术的基础
分子杂交技术的应用： 基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列 的定量和定性、突变分析、疾病诊断等
（三）印迹技术
模板DNA的互补链。
PCR反应体系的建立 总DNA模板 4×dNTPs 引物 1(4mol/L) 引物 2(4mol/L) 10×buffer ExTaq 酶 5 μl 2 μl 1 μl 1 μl 2 μl 1 μl (0.5U)
H2O 总体积
8 μl 20 l
PCR反应体系
1、TaqDNA聚合酶
稀释NaCl至0.14 mol/L
DNP溶液
离心 DNP蛋白
DNP沉淀
转头腔
离 心 机 结 构 示 意 图
转头
沉降样品
驱动马达
真空
冷冻
（二）除去DNP中癿蛋白质 1.SDS法 SDS（十二烷基硫酸钠）可使蛋白质变性， 从而使DNA与蛋白质分开； 2.苯酚法 DNP蛋白 苯酚
变性蛋白质在苯酚相 DNA在水相
PCR法 基因扩增
不同形式的PCR反应
RT-PCR:
PCR技术不仅可以用来扩增DNA模板，而且同 样也可用来扩增被反转录成cDNA形式的特定的RNA 序列。此种在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，特 称为RT-PCR.
它即是一种检测RNA分子的良好方法，也是获取 测序用模板DNA的有效手段，同时还是克隆mRNA之 cDNA拷贝的重要步骤。
人类将进入生物经济时代
基因——操纵生命的工具 基因组——潜藏着巨大的经济价值 基因技术——21世纪的投资热点
谁掌握了人类基因图谱，就等于谁破译了人类 的生命密码，获得了操纵生命的工具。
与互联网相比，网络只是对人类的信息沟通带 来了巨大的革命，而基因领域的革命则能够从根 本上改变人类的命运，基因工程带来的商业机会 将会大大超过网络。
第四章 核酸化学
——DNA和RNA的研究方法
第五节 核酸及其组分的分离纯化
• 一.分离核酸的一般原则 • 在细胞内， DNA， RNA都以核蛋白形式存在，两 者在提取时常混在一起，故提取时应注意： • （一） 防止核酸酶癿降解：
• 细胞内凡有核酸的部位，都有核酸酶存在。故应 加入酶的抑制剂，如柠檬酸钠，EDTA等；
三 核酸的研究方法
（一）DNA的凝胶电泳
——按分子大小来分离，溴化乙锭EB荧光染色
DNA凝胶电泳癿操作步骤
DNA的变性和复性
变性：是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂， 变成单链结构的过程。
复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然 的双螺旋构象，这一现象称为复性。
（二）核酸分子杂交
得到2’-或3’-磷酸核苷癿混合物）；DNA耐碱。
• 酶水解：生物体内存在多种核酸水解酶 ： RNA水解酶 RNase DNA水解酶 DNase
核酸外切酶——从末端逐个切下核苷酸
核酸内切酶——从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶 限制性核酸内切酶 水解某一特定碱基序列——回文结构
限制性核酸内切酶的识别序列
密度梯度离心，亲和层析；
四.核酸组分的分离纯化 核酸用化学方法或酶法可得到碱基，核苷 和核苷酸。根据需要不同，必须将各组分分 离纯化，以获得单一产品。 常用方法有：
离子交换法 凝胶过滤法
（一）离子交换法
核酸组分有多种基团可发生解离，在一定 条件下各组分所带电荷的种类和数量不同，可用
离子交换法分离：
DNA的杂交
• DNA癿杂交：热变性癿DNA单链，在复性时并丌一定不同 源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以不在某些区域有 互补序列癿异源DNA单链形成双螺旋结构,该现象称为~。
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
DNA的杂交
不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一 些局部碱基互补片段在复性时形成杂化双链：
天然复制的DNA分子中，错误掺入的几率大约是 1/109，这是因为校正机制的存在。体外PCR反应， 错误几率大约是1/2×104，这种酶失去了3`－5`的 校正功能。
PCR反应体系
2、寡核苷酸引物
所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段 两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片断，其长 度通常在15-30bp，包括引物1和引物2。1kb之内是 理想的扩增跨度，2kb左右是有效的扩增跨度，3kb 较难以获得有效的结果。 引物也不是越长越好，过长的引物同模板DNA杂交 的速率反而下降了。
DNA沉淀
酒精 离心
（三） DNA癿纯化 1.蔗糖密度梯度离心： 分离分子量大小不等的DNA； 2.氯化铯密度梯度离心： 分离双链和单链DNA；
3.柱层析：
分离天然DNA和变性DNA；
三.RNA的分离纯化 （一）RNA的提取
酚提取法： 用缓冲液饱和的酚溶液直接
处理细胞除去蛋白质和DNA； （二） RNA的分离纯化
基因工程过程示意图
①从细胞中分 离出DNA
③ ①
②限制酶截取 DNA片断 ③分离大肠杆 菌中的质粒
②
④
④ DNA重组
⑤
⑥
⑤用重组质粒 转化大肠杆菌 ⑥培养大肠杆菌 克隆大量基因
——人类基因组计划概况
（Human Genome Project，HGP）
该计划是美国科学家在1985年率先提出，1990年正 式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作， 1999年我国成为 HGP的第六个成员国。 HGP旨在阐明人类基因组DNA所具有的3×109核苷 酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的 位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分 子水平上全面地认识自我。 HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福 于人类，但也面临的伦理的挑战。
早期，使用的是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片断， 但这种酶是热敏感的，因此，每一轮循环反应都需要通过人 工操作不断补充新鲜的聚合酶。此外，Klenow酶的最佳反应 温度是37℃，引物与模板容易形成非专一的碱基错配，降低 了PCR的特异性。
DNA复制的忠实性
1988年，R.K.Saiki成功地将热稳定的TaqDNA聚合酶 应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性。
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜 与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
Southern印迹法癿步骤： • 未知癿DNA → DNA限制性内切酶 → DNA片段 → 琼脂糖电泳分离 --→ 碱液变性 → 影印在硝酸纤维薄膜上--→ 不放射性标记癿已知DNA单链或RNA 杂交 → 放射自显影 • “钓基因 ”
• （二） 注意强酸强碱癿降解作用； • （三） 应在低温和避免剧烈搅拌下进行。
二.DNA的分离纯化
步骤：
细胞
DNP蛋白的提取
取 出 DNA
除去DNP中的蛋白质 DNA的纯化
用限制酶切 断DNA
（一） DNP蛋白的提取
细胞提取物 加1 mol/L NaCl （DNP和RNP)
DNP溶解 分离 RNP沉淀
加热
退火
核酸分子杂交：
• DNA单链不互补癿RNA链之间也可以发生杂交。
不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有 碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸 分子杂交（hybridization）。
杂化双链 ——核酸分子杂交的本质
在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种 类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中， 只要两种单链分子之间存在一定程度的碱基配对 关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就 可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)