溶菌酶简介

溶菌酶综述
耿红健
基础药学基地班
09104103
溶菌酶分离提纯、纯度鉴定以及活力测定综述
耿红健基础药学基地班 0910103
溶菌酶简介
溶菌酶名称起源于1922 年，Alexander Fleming 发现人的唾液、眼泪中存在一种可溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，就命名为溶菌酶。

此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶马等动物乳汁中，也可以从番木瓜、无花果、大麦、卷心菜等植物中可分离菌酶的存在。

溶菌酶广泛存在于动植物体内和人的外分泌液中，可以从牛、羊、出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最丰富，约为0.3%~0.4% 。

溶菌酶是一种碱性球蛋白，其分子由129个氨基酸组成，2200个原子，分子量14388-18000(14388、14500、18000)，等电点为10.7-11.0，分子内有4个二硫键交联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，Sbaharu等报告牛奶中的溶菌酶分子量为18000，一级结构尚未清楚。

人乳中的溶菌酶和a-La的一级结构有74％是相同的。

Ⅱ一La是人乳中含量较多的蛋白质。

它对于乳腺中乳糖的合成是必不可少的．是乳糖合成酶的辅酶。

溶菌酶和d-La在生物学上是同源的，但它们的三级结构有很大的区别。

它可溶解许多细菌的细胞膜．使细胞膜的糖蛋白类多糖发生加水分解作用。

分子中碱性氨基酸、酰氨残基及芳香族氨基酸较高，如色氨酸的比例较高。

酶的活性中心是天门冬氨酸和谷氨酸，溶菌酶通过其肤键中第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成徽生物细胞壁的N_一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁质酸间的B一(1，4)糖苷键，使菌体细胞壁溶解而起到杀死细菌(尤其是球菌)的目的。

此外，溶菌酶的最适温度为50度，最适Ph为6，溶菌酶具有热稳定性，100摄氏度保持十分钟仍具有活性。

溶菌酶是动物自身的重要免疫因子，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶。

具有杀菌消炎、抗病毒、增强免疫力、促进有益菌繁殖等作用，并具有对人禽无毒、无药害残留、无副作用等优点。

目前已经被众多领域广泛应用。

水解细菌细胞壁，在细菌形态学观察中表现出很强的溶菌现象。

并可以阻止流感病毒和腺病毒等病毒的繁殖致病，与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DHA、RNA的脱辅基蛋白直接形成复合盐，使病毒失活。

溶解酶还作为机
体非特异性免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，能提高机体强大抵抗力。

此外，还具有激活血小板机能，改善局部组织血液循环，促进机体损伤组织修复等功能。

主要特点
1、具有消炎、溶菌（杀菌），促进机体组织修复和增强机体免疫力等供销，防治效果显著。

从对临床防治来看，平均预防有效率为95%以上。

治疗有效率达85%以上。

综合性能显著优于目前临床上所使用的常用抗生素药物。

2、抗菌谱广。

对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌等致病菌有抑杀作用。

对耐药菌株效果尤佳，不会产生耐药性。

3、具有抗病毒作用：对流感，呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病有显著的防治效果。

4、与抗生素类药物合并使用时具有增效功能，可适当减少抗生素用量。

5、长期使用能改善肠道的微生态环境。

杀灭有害菌，促进有益菌繁殖，显著提高采食粮；增强消化吸收功能；能明显提高生长速度和饲料利用率，获得很好的经济效益。

溶菌酶本身是属于耐高温的酶，具有高度稳定性，能承受饲料制粒工艺的高温处理几长期储存。

特点功能：
1.用于畜禽及水生动物，由球菌、杆菌等细菌引起的黄白痢、肠胃炎等疾病
治疗和预防，效果显著。

2.抗病毒，对流感、高热和呼吸道疾病及水生动物中的病毒性疾病都有显著
的防治效果。

3.与抗生素类药物合并用药时具有增效功能，可适当减少抗生素的用量，以
防止产生耐药菌。

国际酶学委员会根据其底物及作用特点又称其为酰胺酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，编号E C3.2.1.17，与常见的蛋白酶、淀粉酶一样属水解酶系列。

根据其来源不同一般可将溶菌酶分6 类：C型(chicken)、G型(goose)、无脊椎动物型(invertebrate-type)、噬菌体、细菌和植物来源溶菌酶。

不同来源酶的分
子量、氨基酸组成及酶特性各有不同，但三维结构显示来源于共同的进化起源。

目前对C型溶菌酶研究较多，它是由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，含有4对二硫键，三维结构为较紧密的椭球形，它广泛存在脊椎动物如哺乳动物、鸟、爬行动物及鱼类和无脊椎动物如昆虫、甲壳类中。

溶菌酶基本理化性质及作用机理：①溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白,化学性质非常稳定。

当pH值为1.2～11.3范围内剧烈变化时,其结构几乎不变。

在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强；当pH值为4～7,100℃处理1 min 仍能保持原酶活性;当pH值为3时能耐100℃加热处理45min;在干燥条件下,溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。

黄色的结晶体或无定形粉末,无臭,味甜。

易溶于水,遭碱易破坏,不溶于丙酮和乙醚[5]。

【实验材料】
1.实验器材
循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)
2．实验试剂
⑴鸡蛋清（鲜鸡蛋）
⑵底物微球菌粉
⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂
⑷固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH
4)
2
SO
4
；固体磷酸氢二钠
（Na
2HPO
4
·12H
2
O）；固体磷酸二氢钠（NaH
2
PO
4
·2H
2
O）；固体磷酸钠（Na
3
PO
4
）
⑸乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮
(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50
⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸
⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验二）
⑼聚乙二醇-20000、两性电解质
【实验操作】
1.蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.
2.鸡蛋清粗分离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。

3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析
⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH 搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH 处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于 6.5。

吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L 的磷酸盐缓冲液平衡树脂。

⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。

于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

⑶上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。

⑷洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含 1.0mol/L NaCl 的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。

⑸聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。

当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

(6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。

4.Sephadex G50分子筛柱层析
⑴装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl 溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。

(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。

加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。

⑵上样：与实验五中的方法相同。

⑶洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。

⑷聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

⑸透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。

收集透析液，量取体积。

5. 溶菌酶活力测定
⑴酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.
⑵底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。

5.3 活力测定：先将酶和底物分别放入25O C恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。

然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。

活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度
下降0.001为1个活力单位。

酶的活力单位数=△A
nm/t×0.001
450
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
6.选做实验
（1）溶菌酶的热稳定性：取G50峰2的溶菌酶2ml放入恒温水浴槽中，逐步升温，每隔五度测其酶活力。

（2）溶菌酶的最适Ph值：于小试管中加入1mlG50峰2的溶菌酶，并加入等量缓冲液，Ph分别为4、5、6、7、8，同时将底物pH值调整为4、5、6、7、8，底物与酶的pH值一一对应，在50度的条件下测其酶活力。

（3）米氏常数的测定：配置不同浓度的底物，与等量的酶反应
（4）等电点的测定
等等
附：○1蛋白质含量测定方法比较
一、Folin-酚试剂法（Lowry法）
原理：蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。

反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二部：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色化合物。

该反应30min内接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，骨可用比色的方法确定蛋白质的含量。

进行测定时要根据蛋白质浓度不同选用不同的波长：若蛋白质含量高时（25-100µg）在500mm波长处测定，含量低时（5-25µg）在755mm波长处测定。

最后根据预先绘制的标准曲线求出未知蛋白的含量。

Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质高于5µg即可测得，是测量蛋白质含量应用最广泛的的方法之一。

二、紫外吸收法
原理：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，是蛋白质在280nm紫外光区产生大量吸收，并且则以波长范围的吸收值与蛋白质
的浓度成正比，利用这一特点可定量测定蛋白质的含量。

紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。

三、微量凯氏定氮法
原理：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量，若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。

当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，此过程通常称为“消化”。

但是，这个反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应进行。

消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可是消化液中的硫酸铵分解游离出氨，借助水蒸气蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度中的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。

根据用标准无激素啊的量可计算出待测物中的总氮量。

蛋白质的含氮量为16%，即1g蛋白质中的但相当于6.25g蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25，既得样品中的蛋白质含量。

四、二喹啉甲酸法
BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。

与Lowry方法相比，BCA的操作更简便，试剂更加稳定，几乎没有干扰物的影响，灵敏度更高（微量检测可达0.5µg/ml）,能够用更加灵活。

五、考马斯亮蓝染料结合比色法
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰变成595nm。

而蛋白质含量在1-100µg范围内，蛋白质-染料复合物具有很高的光密度值与蛋白质含量成正比，故可用于比色法鉴定。

蛋白质-染料复合物具有很高的光密度值，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1µg蛋白。

染料与蛋白结合迅速，大约为2min，结合物质的颜色在1h
内稳定。

所以本方法操作简便、快速、灵敏度高，稳定性好，是一种测定蛋白质含量的常用方法。

附○2D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析原理
离子交换树脂是一类具有网状结构的高分子聚合物。

树脂的网状结构的骨架部分一般很稳定，对于酸，碱和一般溶剂都不起作用，且不溶于这些溶剂中。

这种网状结构的骨架上有许多可以被交换的活性基团。

按可以被交换的活性基团的不同，离子交换树脂可分成阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。

离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。

带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。

二、离子交换剂的种类
在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。

（一）按活性功能基团带电荷性质不同
阳离子交换剂—带负电荷，与阳离子交换
阴离子交换剂—带正电荷，与阴离子交换
二）按载体种类不同
1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂
交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。

在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性。

目数：离子交换树脂的颗粒直径大小
Dowex 50 为20-50目
Dowex 20 840m
50 297m
100 149m
（代表二乙烯苯的百分含量）
树脂resin（据所含交换基团的性质分）
阳离子交换树脂
强酸型含磺酸基团(R-SO3H)
中等酸型含磷酸基团(-O-PO2H4)
弱酸型含酚基、羧基
阴离子交换树脂
强碱含季胺基团[-N+(CH3)3]
弱碱含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2
阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。

考虑因素：
1.被分离物质带何种电荷
2.被分离物质分子的大小
大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素
3.被分离物质所处的环境
4.被分离物质的物理化学性质
5.被分离物质的大概数量
根据分离过程的实验条件
强酸强碱—应用广泛
弱酸型—只能在碱性pH范围内使用
弱碱型—只能在酸性pH范围内使用
二）缓冲液的选择
原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。

避免使样品变性
(三)洗脱剂
原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团
改变pH或离子强度
增强洗脱液与离子交换剂的结合力
降低分离物与离子交换剂的结合力
洗脱方式：梯度洗脱
四、应用
分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子
本实验,用磺酸阳离子交换树脂分离碱性蛋白质溶菌酶（等电点为10），缓冲液pH为6.5，在此条件下，溶菌酶带正电荷，与树脂中的Na+交换被吸附在树脂上；而大多数蛋白质的等电点为5左右，在此条件下带负电，因此杂蛋白先出柱而溶菌酶蛋白后出柱，从而达到分离的目的。

○3酶活力的测定
1 底物的制备
将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养( 28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤, 4000rpm 离心10min, 弃上清,再洗菌体数次, 最后用少量无菌水制成悬液, 冷冻干燥即得干菌粉。

取干菌粉5g,加入少量
0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min, 倾出并稀释至20～25mL,悬液的光密度OD
在0.5～0.7范围为宜。

450
2 酶液的制备
准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L
酶液。

3 酶活力测定
将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～15min, 测底物悬液的OD
450值,作为对照。

然后加入酶液0.2mL(约10μg酶蛋白)迅速摇匀。

从加酶时开始记
值,共测3次。

时, 每30s测1次OD
450
4 酶活力的计算
以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位。

溶菌酶活力=ΔOD450/(0.001×W)(U/mg)
式中, ΔOD
为450nm 处每分钟吸光度的变化；W为加入的酶量(mg)。

450
小结与讨论
关于酶的纯化上, 蛋清中溶菌酶的等电点在pH10.8 左右, 在偏酸性和偏碱性溶液中, 其稳定性都比较好, 蛋清中其他蛋白杂质的等电点约在pH4.6～5.0 左右, 适量酸的添加既不会破坏溶菌酶, 又便于蛋白杂质的沉淀, 使溶菌酶得到分离纯化。

对于酶活力的高低, 温度对其影响比较大, 温度低时产品纯度低, 导致酶活力降低; 而温度过高时, 可导致酶蛋白发生不可逆变性, 同样造成酶活力下降。

所以温度控制要适当。

除此之外, 酶活力还与酶的纯度相关。

因此, 可在透折后用超滤工艺使酶液得到浓缩, 从而提高酶的比活力, 同时又可除去大部分蛋白杂质[10]。

○4溶菌酶纯度的鉴定
实验仪器与试剂
1．实验仪器
SDS-PAGE电泳设备，电炉，脱色摇床
2. 实验材料及试剂
实验材料：蛋清（S1）、粗分离样品（S2）、离子交换层析中穿透峰下降段样品（S3）、离子交换层析洗脱峰样品（S4），橡胶手套
实验试剂：2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液
实验步骤
（一）蛋白样品的处理
取200µL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200µL 的2×上样缓冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100℃沸水浴中加热3～5min，取出后10000r/min 离心10min，取上清待用。

（二）SDS-PADE实验步骤（适用于大板，若为天能公司的小板，参考附录中的方法）
1．电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。

( 试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

)
2．用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至55℃左右，加入制板槽槽内封板。

（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.）3．按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。

（凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。

水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。

凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。

）
4．倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置25分钟。

（样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。

）
5．拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。

（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.）
6．加样5个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。

其中蛋清（S
1
）和Marker加样量为2µL，S1、S2、
S 3、和S
4
加样量为10µL。

为了练习和比较上样量的影响，可以加20µL的S1～
S
4
作为对照（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。

为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。

）
7．电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160V，当进入分离胶后改为240V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

8．凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切
下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min 左右。

（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。

）
9．脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

10．将凝胶室温保存于10％甘油水溶液中，至凝胶扫描分析。

11．凝胶扫描仪扫描并进行数据分析,求出溶菌酶的相对分子质量。

分析各样品中溶菌酶相对含量的变化。

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