杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。

目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽
然已发现用于害虫防治。

DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。

复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。

分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。

插入，因此就是表达大片段。

该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。

核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。

，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。

包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证
病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。

，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。

昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒
就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。

BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。

生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。

该
病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。

其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。

由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。

本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。

AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期
基因表达与极晚期基因表达。

前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。

其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复
制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。

多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。

1、杆状病毒基因组得结构与功能研究
以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。

DNA 杆状病毒基因组为双链环状
在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜
(envelope)后形成病毒粒子。

核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白与髓核(COle)。

其中衣壳蛋白就是杆状病毒粒子得主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子与与其密切相关得碱性蛋白构成。

碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序得超螺旋结构。

目前已知基因组全序列得杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。

目前AcMNPV基因组得研究最为深入，它就是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。

AcMNPV基因组得基因组织(gene organization)较为复杂，基因组得不同区域具有功能分化，基因得分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等得重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间得不完整回文序列及其两侧各约20bp得序列构成。

同源区就是杆状病毒基因组普通存在得功能域结构，对于基因表达得调节具有增强作用，同时也就是 DNA复制得原点。

杆状病毒中现已鉴定得基因近70种，可分为结构蛋白基因与非结构蛋白基因两大类。

结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6、9、gp41、vp39等基因。

非结构基因中，与DNA复制相关得重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用得基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。

这些代表性基因与其功能得关系见表1。

2．杆状病毒载体表达系统得特点
AcNPV病毒用作外源基因得表达载体，通常就是通过体内同源重组得方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。

由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录与翻译，一直持续到70 h。

外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒得感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒得功能。

杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白得表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。

相对其她表达系统它具有以下几个方面得特点：
①组蛋白具有完整得生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达得外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键得搭配及寡聚物得形成提供良好得环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②②能进行翻译后得加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整得翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段得切割与分解等，修饰得位点与天然蛋白在细胞内得情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生得糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰得寡糖种类却不完全一样。

这种不一致对不同目得蛋白得活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面得理想模型。

③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出得特点就就是能获得重组蛋白高水平得表达，最高可使目得蛋白得量达到细胞总蛋白得50％。

④能容纳大分子得插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大得基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳得外源基因长度得上
限。

⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时④表达多个基因得能力。

既可采用不同得重组病毒同时感染细胞得形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性得异源二聚体或多聚
体。

另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切得功能，能表；还有对重组蛋白进行定位得功能，如将核蛋白转送到细胞核DNA达基因组上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。

最后，杆状病毒％动物细胞中没有对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N- 活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性得蛋白时可能优于其它系统。

⑤
杆状病毒载体得重组与筛选．3外源基因得克隆不能通过酶切连接得
方式直接插杆状病毒由于基因组庞大，克隆)(如多角体基因及其边界区入，必须通过转移载体得介导．即将极晚期基因'端对高效表达入细菌得质粒中，消除其编码区与不合适得酶切位点，保留其5即得到转移必需得调控区，并在其下游引入合适得酶切位点供外源基因得插入，共转染AcNPV DNA载体。

将要表达得外源基因插入其启动子下游，再与野生型使多角体蛋白基因被外源昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，由于多角体基因被破坏，基因取代。

而将外源基因整合到病毒基因组得相应位置，可同野生型具有多角体得则不能形成多角体。

这种表型在进行常规空斑测定时，但由于重组效率较，这就就是最初得筛选重组病毒得方式。

病毒空斑区别开来
经过不断探索，为此，，)表型差别不显著，应用上有一定得困难。

(0、1％-1％低在重组杆状病毒得筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。

半乳糖苷酶得蓝白筛选1
2 体外酶促定位重组
Bacmid 3
TK基因4
Neo5
基因
3.1．半乳糖苷酶得蓝白筛选
1990年，Vialard等在多角体基因得上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。

将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒得筛选。

1990年，Kins提出了线形化技术，其原理就是线形化得杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内得同源序列进行同源重组得能力。

如果同源序列位于线形化杆状病毒得两端，则基因组即可环化恢复完整得感染性，使阳性重组率大大提高。

蓝白斑筛选
蓝白斑筛选就是一种基因工程常用得重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生得β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯
-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖与深蓝色得物质5-溴-4-靛蓝。

有色物质
而颜色变化就是鉴定与筛选得最直观有效得可以使整个培养菌落产生颜色变化，方法。

这种宿半乳糖苷酶缺陷型菌株设计适用于蓝白斑筛选得基因工程菌为β-半乳糖-主菌得染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶得基因突变，造成其编码得β从而不具有生物活性，，段一个146个氨基酸得短肽（即α肽链）苷酶失去正常Nlacz'用于蓝白斑筛选得载体具有一段称为即无法作用于X-gal产生蓝色物质。

半乳糖苷酶得启动子；编码α肽链得区段；一个-得基因，lacz'中包括：一段β得选择性插入DNA(MCS)。

MCS位于编码α肽链得区段中，就是外源多克隆位点虽然上述缺陷株基因组无法但其本身不影响载体编码α肽链得功能活性。

位点，得质粒后，质粒lacz'单独编码有活性得β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带半乳糖苷酶突变体-lacz'基因编码得α肽链与菌株基因组表达得Ｎ端缺陷得β生成蓝色物质得能力，这种X-gal互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同得作用互补。

现象即α-半乳lacz'中得β--Ｄ-半乳糖苷)以激活操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β以上就是携在含有X-gal得固体平板培养基中菌落呈现蓝色。

糖苷酶得启动子，得载体连接DNA（即目得片段）与含lacz'带空载体得菌株产生得表型。

当外源，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它时，会插入进MCS半乳糖苷酶，即不可分解培导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β- 养基中得X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。

得平板培养基含X-gal 实验中，通常蓝白筛选就是与抗性筛选一同使用得。

一次筛选可以判中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应得抗生素，这样，断出：未转化得菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒得菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒得菌，即目得重组菌，长成白色菌落．体外酶促定位重组 3、2个重组位点含有1SternbergCre-Loxp系统最早由等最早建立，噬菌体Pl
为重组所必需：酶)个Cre酶基因，其产物(CreLox(1ocus of(rossover)与1bp 个核苷酸组成，其两端为13 Lox序列已被测定由34Cre酶已被克隆纯化；基因组即得将此序列引入AcNPV8 bp得非回文序列。

得反转重复序列。

中间为。

lox 后可获得ploxvAclox，转移载体引入酶存在条件下，两者即可发生体外定点重组，而将载体Cre plox在vAclox与将反应混合物转，个可逆酶促反应)(上得相应序列转到病毒得基因组中这就是1细胞中，即可得到高比例得重组子代frugiperda)sf草地夜蛾(spodoptera 染通过控制反应得条件可达到很高得重
组率。

这个方法得特点就是体外重组，病毒。

反应产物往往就是转移载体多次插入亲代病毒得但由于重组就是位点特异性得，结果，因而要进行多轮空斑实验纯化病毒。

3.3.Bacmid
后来Luckow等又发明了一种新得杆状病毒重组技术。

她们根据 F因子载体原理，用类似于酵母体内重组得方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。

该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。

Bacmid 含有F因子复制子(可在大肠杆菌中复制)、卡那霉素抗性基因及Tn7转座位点attTn7。

转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下，两端分别为Tn7得左右端。

以其转化含Bacmid得E coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基因转到 Bacmid得attTn7位置。

这种重组了外源基因得 Bacmid转染得昆虫细胞，可得到 100％阳性重组病毒。

这种方法都就是同样不需进行空斑纯化。

，由于没有本底干扰非常简便，在大肠杆菌中进行得，
缺点就是 F因子提取不很方便，其稳定性也有待于观察。

英文全称 Baculovirus plasmid 中文解释杆状病毒质粒 [带有杆状病毒基因
组得质粒，可在细菌与昆虫细胞之间穿
] 梭
Baculovirus plasmid简易提取方法：
挑白斑摇菌8h左右（一般会过夜摇），取2ml菌液，12000rpm ，30s，弃上清即可
1．溶液I—溶菌液：（加 300ul 将离心完得菌液混匀）
溶菌酶：它就是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁得主要化学成分肽聚糖中得β
-1,4糖苷键，因而具有溶菌得作用。

当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液得粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA得降解作
用（DNase作用时需要一定得金属离子作辅基）;（2）EDTA得存在，有利于溶菌酶得作用，因为溶菌酶得反应要求有较低得离子强度得环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液(加300ul ，裂解5min，轻柔混匀，最好不要拿枪吹，上下颠倒混匀就行)：NaOH：核酸在pH大于5，小于9得溶液中，就是稳定得。

但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键得解离而变性。

在溶液II中得NaOH浓度为0、2mo1/L，加抽提液时，该系统得pH就高达12、6，因而促使染
色体DNA与质粒DNA得变性。

SDS（2%）：SDS就是离子型表面活性剂。

它主要功能有：（1）溶解细胞膜上得脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。

（2）解聚细胞中得核蛋白。

（3）SDS 能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质得复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。

但就是SDS能抑制核糖核酸酶得作用，所以在以后得提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3、溶液III--3mol/L NaAc（pH
4、8）溶液（主要就是沉淀蛋白得，加后轻柔
混匀，冰上放置15min）： NaAc得水溶液呈碱性，为了调节pH至4、8，必须加入大量得冰醋酸。

所以该溶液实际上就是NaAc-HAc得缓冲液。

用pH4、8得NaAc 溶液就是为了把pH12、6得抽提液，调回pH至中性，使变性得质粒DNA能、DNA 有利于变性得大分子染色体NaAc3mol/L 而高盐得并能稳定存在。

够复性，
减少前者就是因为中与核酸上得电荷，以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。

RNA －蛋白复合物作用后，能形成较小SDS相斥力而互相聚合，后者就是因为钠盐与得钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

，：1）、将冰上放置得混合液12000rpm，10min 离心，取上清加异丙醇（1410min
左右，再12000rpm离心然后冰上放20min管底部1ml洗一下（加完后应该能瞧到在EP5、弃上清，加预冷得75%乙醇有一小块白色得沉淀），12000rpm离心）、然后弃乙醇，留下白色沉淀（如果沉淀飘起，可以再6 TE或双蒸水凉干，加50ul 左右）（一般情况下应该有80-100ng/ul溶解片刻即可。

基因、4．TK3该核苷可将核苷类似物转变成得有毒得中间体而抑制病毒得复制。

胸苷激酶得底物，能特异性地抑制单纯疱疹TK)(HSV—类似物作为疱疹病毒编码胸苷激酶病毒得
复制。

由于这些类似物对病毒得胸苷激酶有高度病毒、巨细胞病毒与EB选择性地杀而细胞自身胸苷激酶对这些类似物得结合常数很低，故能得选择性，。

死表达HSV-TK基因得细胞 Loss of the tk gene TK基因缺失
编码胸苷激酶tk），VZV－基因编码区大片段缺失 tk基因（包括HSV－tkTK还可以催化一些核苷类除可以催化脱氧胸苷变成脱氧胸普酸，，病毒得TK（TK）近年，许多学似物磷酸化，这些磷酸化后得核苷类似物对哺乳细胞有根强毒性。

者用多种载体将病毒止基因转入肿瘤细胞，配合核苷类似物作为前药治疗肿瘤，动物实验效果肯定，现正进入临床研究。

3.5．Neo基因
Neo抗新霉素得抗药基因,一般用来作为基因表达载体得筛选、表达目得基因得载体同时带有该基因、这样在培养液加入新霉素、没有被转染得细胞没有抗药性,就不能存活、
Neo就是经典得显性选择标记，这就是一种细菌编码得磷酸转移酶基因，可使氨基糖苷类抗生素 G418失活。

后者又就是一种蛋白质合成抑制剂，可干扰真核细胞80S功能。

Neo曾被引入几种脊椎动物病毒(如痘苗病毒与EB病毒)得基因组中，作为选择标记。

1989年，Jarls将Neo引入sf细胞染色体中而得到 G418抗性得细胞系，说明Neo可作为选择标记用于重组病毒得筛选。

本方法与TK基因相
比较略显繁琐，需经连续传代，但其不用改造辅助病毒，只需在转移载体中引入Neo基因即可。

其它如 PCR、DNA斑点杂交及有限稀释法等，也可用于筛选重组病毒。

以上方法各具特点。

虽然有些新方法需一定得条件，但一旦建立起来后就可方便、迅速地得到重组病毒，为杆状病毒表达系统得普及应用创造了良好得条件
4 ．影响外源蛋白表达得因素
利用杆状病毒昆虫表达系统表达外源基因得理论基础，就就是杆状病毒得基因表达与调控，但有关病毒晚期基因高表达与其调控机制目前还不十分清楚。

利用多角体基因得启动子表达外源基因，影响表达水平得因素除与病毒本身得因素有关外，还与受感染细胞得种类与生理状况乃至培养基得质量有关。

4、1．病毒得稳定性杆状病毒在细胞中多次传代后，可能引起基因组得变化。

最明显得变化就就是形成ov得能力降低。

由于细胞间不需要ov形成感染，只需通过BV病毒感染即可。

多次传代得病毒也可能出现少多角体(few polyhedfin，FP)表型得变化，一般每个感染细胞只含有10个多角体病毒。

其中突变病毒多角体得表达水平也有所降低，应用这种突变病毒会对外源基因得表达带来不利。

若重组前病毒就是变异FP，通过肉眼分辨重组与非重组病毒时，有可能发生假象。

另外，长期多次传代得病毒也往往引起表达水平得降低，为避免上述情况得发生，要限制病毒得传代次数，一般控制在2-3代以内。

4、2．在昆虫细胞内表达与幼虫体内表达虽然目前大部分工作就是在细胞培养条件下进行得，当需要大量制备某类表达产物时，最好采用昆虫蛹。

因为培养昆虫幼虫远比培养细胞简单、便宜，而且在昆虫体内培养可以提高表达量。

一般在幼虫体内得淋巴液中，蛋白含量较在细胞培养基中高l0倍以上，例如小鼠IL-3得表达量在淋巴液中较在细胞培养上清中高500倍，可能就是细胞培养基中含有得蛋白酶使之降解所致。

4、3．启动子类型在构建转移载体时，使用不同得启动子就需构建相应得同源序列。

目前最常用得启动子有晚期Polh(polyhedrin)启动子与P10启动子，还有碱性启动子以及少数早期启动子。

同一目得基因在不同启动子控制下，表达水平会有很大差异。

研究发现，分泌类蛋白使用PIO启动子或碱性启动子得效果更好。

4、4．外源基因序列得本身因素能在重组杆状病毒有效表达得外源基因5'端及3'端非编码区越短越好，一般长度在3～400个核苷酸以内。

影响表达得其她因素包括：密码子得使用情况(就是否为昆虫细胞所常用)、mRNA 得稳定性及蛋白质得稳定性等。

外源基因附近得序列很重要。

Kozak分析了数百个真核序列，得出两点结论：首先，启动子下游第1个ATG常作为起始密码子；其次就是在 ATG附近得序列并不就是随机得。

有95％表达得真核基因在ATG前-3位就是嘌呤(而且常就是A)，+4位就是G。

如果-3得A或+4得G有1个被嘧啶替代，翻译水平就下降5~l0倍。

如果-3位与+4位均被嘧啶所替代，翻译水平就下降20倍。

因此，Kozak提出，(GCC)GGC A／GCC AUG G就是高等真核基因起始密码附近得保守序列，其中-3处A最为保守。

4、5．重组病毒基因得表达与调控
多角体启动子控制得外源基因得表达，紧靠上游得序列对基因得转录调节就是最重要得。

许多研究表明，当外源基因5 端加有1～58个多角体蛋白得氨基酸序列以融合蛋白形式表达时，效果最好。

用高、中与低3种表达得外源基因进行实'端序列与外源基因以相同得框架相融合，5验得结果表明，保留一部分多角体．表达水平最高；如果框架不同，那么从距启动子最近得起始码开始翻译，表达产物水平相对偏低。

5 ．昆虫杆状病毒系统表达外源基因得新进展
1 杆状病毒载体及其表达系统进展
昆虫杆状病毒表达系统进行外源基因表达时，存在得一个问题就是筛选带有外源基因得重组病毒得效率较低(最初仅0、1％～1％)，而且产物较难纯化。

为此，
人们设计了各种方法来改进病毒载体，如 NPV DNA线性化，体外定点酶促重组，以及酵母-昆虫细胞与大肠杆菌-昆虫细胞得穿梭载体得开发等。

其中Posse等设计得重组-救活可线性AcNPV病毒载体BacPAK6得重组效率较高，高达80％以上，具有重要得应用价值。

该重组技术得基本原理为：先找一个在 AcMNPV基因组中不存在得 Bsu36 I酶切位点，采用体外突变，在多角体基因两侧得非必需基因ORF603基因与必需基因ORF1629基因中各引入一个Bsu36 I位点，然后通过重组将突变了得由ORF603基因、多角体基因启动子控制得半乳糖苷酶基因、ORF1629基因引入AcNPV基因组，获得重组病毒载体BacPAK6。

(BacPAK6)DNA经Bsu36 I酶切而破坏了必需基因OBF1629，因而靠自身环化不能成活，必须与携带多角体蛋白基因启动子控制得外源基因与OBF1629基因得转移载体发生重组，病毒才能复制而救活，因此，该法得重组率很高。

这一系统现已扩展到了BmNPV表达系统。

易咏竹等副通过克隆得家蚕核多角体病毒解螺旋基因DNA，与重组救活可线性化得苜蓿尺蠖核多角体病毒基因工程载体病毒(BacPAK6)DNA在昆虫细胞中
发生重组，经累代筛选获得了既可感染家蚕又可感染秋粘虫细胞Sf-21得宿主域扩大得昆虫杆状病毒表达载体(HyBacPAK6)，它与含植酸酶基因得转移载体
Pvl1393phy在家蚕细胞中得重组率达90％以上。

此外，Bac—to．Bac表达系统就是效率很高得表达系统，它利用穿梭质粒bacmid 在大肠杆菌中高效复制后，再提纯用于转染昆虫细胞，大大缩短了时间。

王汉中等根据BactoBac表达系统得基本原理，也构建了一种新颖得棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统(HaBac—to—Bac)。

该系统中供体质粒pFastPhP10中插入了带有多角体启动子序列得完整得多角体蛋白基因，因而多角体蛋白基因得表达与包涵体得形成也可作为转染成功得重要识别标记等，这就是商品化得 AcBac —to．Bac系统所不具备得。

目前可被应用于昆虫杆状病毒表达系统得细胞系较多，但应用较多得细胞系就是秋粘虫s、frugiperda卵巢组织得细胞系sf-9，以及家蚕细胞系。

洪华珠等建立了一株高水平表达重组蛋白得昆虫细胞系HNU—Tn、FB1。

它就是粉纹夜蛾Trichoplusia ni脂肪体得传代细胞系。

在辅以 5％胎牛血清得商品无血清培养基 Excell400中，该细胞群体得倍增时间为22、9h，最高密度可达2、2×106／ml，表达由AcMNPV构建得重组p、半乳糖苷酶得水平达(225、5±13、4)IU/ml。

该细胞系在表达重组蛋白方面与目前商业上最好得“高五”细胞(BTI．Tn．5B1-4)相当，就是一株很有价值得细胞系，具有广阔得应用前景。

另外，一些影响杆状病毒系统表达外源基因产物得因素在近两年得到了研究。

杆状病毒吸附宿主细胞得动力学参数就是影响细胞感染效果与表达物产量得因素之一。

Petricevich等以表达轮状病毒得重组蛋白VP4为例，对病毒吸附动力学得参数进行了研究，发现影响细胞感染效果得主要参数就是胎牛血清浓度。

不用胎牛血清或经高温处理后再使用，反而可以获得更高浓度得表达产物。

．
重组病毒感染 sf-9得效果与细胞周期有关，Saito等对GFPuv基因在杆状病毒系统中表达得研究表明，当在宿主细胞得G、期感染时，细胞内得荧光强度就是在G2／M期感染得 1、3倍，同时在宿主细胞得G。

/S期感染时，感染量就是在G：/M期感染得1．5-1．8倍。

该研究结果对于选择病毒感染宿主细胞得时期有一定得借鉴意义。

01ejnik等讨论了高渗透压对昆虫细胞表达重组蛋白产量得影响。

采用补料分批。