固定化脂肪酶载体的筛选

农业基础科学现代农业科技2012年第5期

脂肪酶（lipase）是一类特殊的酰基水解酶和重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，且在异相体系中具有催化活性，广泛应用于生物柴油的制备、手性化合物的拆分、油脂改性等方面的研究[1-3]。但由于脂肪酶的造价昂贵，对环境耐受力低，稳定性较差，且游离酶不易于回收、难以重复回收利用，使脂肪酶在工业化生产中深受其限[4]。为此，通过固定化技术和蛋白质工程来大幅提高脂肪酶的综合催化性能已成为当今研究热点。

高阳等[5]以不同大孔树脂吸附法固定化假死酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA 是最佳的固定载体。王冰等[6]以沙蒿—壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，对影响酶活力的各种因素进行了分析研究。杨本宏等[7]研究了海藻酸钠法制备固定化德氏根霉脂肪酶的条件。但许多固定方法在单独使用和催化生成不同产物时都存在缺点。如：吸附法中酶与载体之间的作用力弱，对外界环境要求严格，且吸附存在非特意性易引入杂质；包埋固定化酶易流失，不利于保存，且对短链醇的有机耐受性差；共价交联过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中容易失活等[8]。本研究通过对不同固定化材料进行比对分析，选择针对生产生物柴油所需的固定化脂肪酶进行研究，为今后的研究提供参考。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试药剂。海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：脱乙酰远远大于90.0%，国药集团化学试剂有限公司；大孔树脂：P3520，天津南开大学化工厂；硅藻土：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶：阿拉丁试剂公司，10万U/g；三丁酸甘油脂：阿拉丁试剂公司。

1.1.2主要仪器。电子天平：德国赛多利斯股份公司；恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；PB-10数字酸度计；多用途台式恒温振荡器：DDHZ-300。

1.2试验方法

1.2.1脂肪酶的海藻酸钠固定。准确称取1.0g海藻酸钠加入蒸馏水90mL，加热溶解后制备成海藻酸钠溶液，冷却至30℃。将酶液10mL加入到海藻酸钠溶液混匀。用注射器抽取混合液10mL，缓慢推动注射器将混合液从针头滴到4%（w/v）CaCl2溶液中，制得直径为2~3nm的球形颗粒。制得的颗粒继续在CaCl2溶液中浸泡30min，以形成稳定结构。定性滤纸过滤获得球状颗粒的固定化酶，用蒸馏水洗2次。

1.2.2脂肪酶的壳聚糖微球固定化。称取壳聚糖1.0g溶于2%的乙酸溶液，制得2.5%的壳聚糖酸性溶胶。边搅拌边将上述溶胶缓慢加入到80mL液体石蜡和5mL Span-80的混合液中，搅拌20min，使溶胶液均匀分散。加入25%戊二醛溶液1.0mL，搅拌10min后，用1moL/L的NaOH溶液将其pH值调至9~10，于70℃水浴保温3h。放置冷却后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，60℃真空干燥得到壳聚糖微球。在pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中加入一定量的酶，与壳聚糖微球0.2g在室温搅拌3h。加入戊二醛至浓度为2%，充分交联8h。用去离子水冲洗3遍，过滤，干燥即得固定化酶。

1.2.3脂肪酶的大孔树脂固定化。将大孔树脂用去离子水浸泡涨润，去杂，后用4%NaOH和4%HCl交替在磁力搅拌器下搅拌浸泡2h，并分别用去离子水冲洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。称取1.0g 经预处理在真空抽滤后的树脂（湿基）于50mL三角烧瓶中，加入含有一定量酶的缓冲液5mL控制温度恒定，转速110r/min，在恒温振荡器中吸附固定。加入稍过量戊二醛，充分交联8h。用去离子水冲洗3遍。固定完成后，移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。抽滤用5℃的去离子水洗涤得到固定化酶。

1.2.4脂肪酶的硅藻土固定化。将载体用去离子水浸泡去杂，烘干后充分研磨备用。用5%HCl浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。用5%NaOH浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。称取1.0g经预处理在真空抽滤后的载

固定化脂肪酶载体的筛选研究

李明廓陈光*王刚

（吉林农业大学，吉林长春130118）

摘要针对不同固定化载体，进行了适合生物柴油生产的脂肪酶固定化载体筛选试验。结果表明，以壳聚糖微球的固定率和甲醇耐受力相对较好，其最适给酶量为30mg，固定化时间为8.0h，pH值为7.0，固定化温度为40℃。

关键词脂肪酶；固定化；载体；筛选；酶活力；影响

中图分类号Q814.2文献标识码A文章编号1007-5739（2012）05-0024-03

Screening Research of Enzyme Immobilization Carrier

LI Ming-kuo CHEN Guang*WANG Gang

（Jilin Agricultural University，Changchun Jilin130118）

Abstract In order to explored the suitable immobilization of lipase（LPS）processed by biodiesel fuel，4kinds of carries for lipase were compared in this paper.Results showed that the attachment rate and methanol tolerance of chitosan microspheres was the best optimum enzyme amount，immobilized time，pH value，immobilized temperature were30mg，8.0h，7.0，40℃，respectively.

Key words lipase；immobilization；carrier；screening；enzyme activity；effect

作者简介李明廓（1986-），男，吉林吉林人，在读硕士。研究方向：生

物反应器开发与酶工程。

*通讯作者

收稿日期2011-12-31

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