固定化脂肪酶载体的筛选

农业基础科学现代农业科技2012年第5期
脂肪酶（lipase）是一类特殊的酰基水解酶和重要的工业酶制剂品种，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，且在异相体系中具有催化活性，广泛应用于生物柴油的制备、手性化合物的拆分、油脂改性等方面的研究[1-3]。

但由于脂肪酶的造价昂贵，对环境耐受力低，稳定性较差，且游离酶不易于回收、难以重复回收利用，使脂肪酶在工业化生产中深受其限[4]。

为此，通过固定化技术和蛋白质工程来大幅提高脂肪酶的综合催化性能已成为当今研究热点。

高阳等[5]以不同大孔树脂吸附法固定化假死酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA 是最佳的固定载体。

王冰等[6]以沙蒿—壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定脂肪酶，对影响酶活力的各种因素进行了分析研究。

杨本宏等[7]研究了海藻酸钠法制备固定化德氏根霉脂肪酶的条件。

但许多固定方法在单独使用和催化生成不同产物时都存在缺点。

如：吸附法中酶与载体之间的作用力弱，对外界环境要求严格，且吸附存在非特意性易引入杂质；包埋固定化酶易流失，不利于保存，且对短链醇的有机耐受性差；共价交联过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中容易失活等[8]。

本研究通过对不同固定化材料进行比对分析，选择针对生产生物柴油所需的固定化脂肪酶进行研究，为今后的研究提供参考。

1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1供试药剂。

海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖：脱乙酰远远大于90.0%，国药集团化学试剂有限公司；大孔树脂：P3520，天津南开大学化工厂；硅藻土：国药集团化学试剂有限公司；脂肪酶：阿拉丁试剂公司，10万U/g；三丁酸甘油脂：阿拉丁试剂公司。

1.1.2主要仪器。

电子天平：德国赛多利斯股份公司；恒温磁力搅拌器：金坛市富华仪器有限公司；PB-10数字酸度计；多用途台式恒温振荡器：DDHZ-300。

1.2试验方法
1.2.1脂肪酶的海藻酸钠固定。

准确称取1.0g海藻酸钠加入蒸馏水90mL，加热溶解后制备成海藻酸钠溶液，冷却至30℃。

将酶液10mL加入到海藻酸钠溶液混匀。

用注射器抽取混合液10mL，缓慢推动注射器将混合液从针头滴到4%（w/v）CaCl2溶液中，制得直径为2~3nm的球形颗粒。

制得的颗粒继续在CaCl2溶液中浸泡30min，以形成稳定结构。

定性滤纸过滤获得球状颗粒的固定化酶，用蒸馏水洗2次。

1.2.2脂肪酶的壳聚糖微球固定化。

称取壳聚糖1.0g溶于2%的乙酸溶液，制得2.5%的壳聚糖酸性溶胶。

边搅拌边将上述溶胶缓慢加入到80mL液体石蜡和5mL Span-80的混合液中，搅拌20min，使溶胶液均匀分散。

加入25%戊二醛溶液1.0mL，搅拌10min后，用1moL/L的NaOH溶液将其pH值调至9~10，于70℃水浴保温3h。

放置冷却后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，60℃真空干燥得到壳聚糖微球。

在pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中加入一定量的酶，与壳聚糖微球0.2g在室温搅拌3h。

加入戊二醛至浓度为2%，充分交联8h。

用去离子水冲洗3遍，过滤，干燥即得固定化酶。

1.2.3脂肪酶的大孔树脂固定化。

将大孔树脂用去离子水浸泡涨润，去杂，后用4%NaOH和4%HCl交替在磁力搅拌器下搅拌浸泡2h，并分别用去离子水冲洗至中性，最后用2倍体积以上去离子水浸泡于4℃冰箱中保存备用。

称取1.0g 经预处理在真空抽滤后的树脂（湿基）于50mL三角烧瓶中，加入含有一定量酶的缓冲液5mL控制温度恒定，转速110r/min，在恒温振荡器中吸附固定。

加入稍过量戊二醛，充分交联8h。

用去离子水冲洗3遍。

固定完成后，移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。

抽滤用5℃的去离子水洗涤得到固定化酶。

1.2.4脂肪酶的硅藻土固定化。

将载体用去离子水浸泡去杂，烘干后充分研磨备用。

用5%HCl浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。

用5%NaOH浸泡载体2h，然后用去离子水冲洗至中性。

称取1.0g经预处理在真空抽滤后的载
固定化脂肪酶载体的筛选研究
李明廓陈光*王刚
（吉林农业大学，吉林长春130118）
摘要针对不同固定化载体，进行了适合生物柴油生产的脂肪酶固定化载体筛选试验。

结果表明，以壳聚糖微球的固定率和甲醇耐受力相对较好，其最适给酶量为30mg，固定化时间为8.0h，pH值为7.0，固定化温度为40℃。

关键词脂肪酶；固定化；载体；筛选；酶活力；影响
中图分类号Q814.2文献标识码A文章编号1007-5739（2012）05-0024-03
Screening Research of Enzyme Immobilization Carrier
LI Ming-kuo CHEN Guang*WANG Gang
（Jilin Agricultural University，Changchun Jilin130118）
Abstract In order to explored the suitable immobilization of lipase（LPS）processed by biodiesel fuel，4kinds of carries for lipase were compared in this paper.Results showed that the attachment rate and methanol tolerance of chitosan microspheres was the best optimum enzyme amount，immobilized time，pH value，immobilized temperature were30mg，8.0h，7.0，40℃，respectively.
Key words lipase；immobilization；carrier；screening；enzyme activity；effect
作者简介李明廓（1986-），男，吉林吉林人，在读硕士。

研究方向：生
物反应器开发与酶工程。

*通讯作者
收稿日期2011-12-31
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体于50mL 三角瓶中，加入含有一定量酶的缓冲液5.0mL 控制温度恒定，转速110r/min ，在恒温振荡器中吸附固定。

加入稍过量戊二醛，充分交联8h 。

用去离子水冲洗3遍。

固定完成后移取一定量的上清液，测定酶的吸附率。

抽滤用5℃的去离子水洗涤得到固定化酶。

1.3检测及计算方法
1.3.1
脂肪酶酶活力计算。

将1.0mL 三丁酸甘油酯与3.0mL
甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（pH 值9.4）加入50mL 具塞三角瓶中，在140r/min 、35℃恒温摇床中振荡乳化15min 。

然后取出并加入酶制剂5μL ，再置于140r/min 、35℃摇床反应
10min 后取出并立即加入95%乙醇10mL 终止反应。

以1%
酚酞为指示剂，利用0.1moL/L 氢氧化钠溶液滴定至粉红色，记录溶液消耗体积V 1。

空白试验中重复上述步骤但不加酶制剂，记录氢氧化钠溶液消耗体积V 0。

定义每1min 催化三丁酸甘油脂水解产生1μmoL 丁酸所需要的酶量为1个酶活单位（LU ，Lipase Unit ），酶活计算公式为：
酶活（LU/mL ）=V 1-V 05×10
×0.1×10-6
1.3.2脂肪酶固定率计算。

脂肪酶固定率计算公式为：
K =U 2U 1
×100%
式中，U 1为1.0mL 酶液的酶活；U 2为相当于1.0mL 酶液的固定化酶的酶活；固定化酶比活力（U/g ）定义为固定化酶酶活力/固定化酶质量。

2结果与分析
2.1
利于生产生物柴油的固定化载体筛选
2.1.1
不同固定材料固定脂肪酶的效率分析。

取相同质量
的不同载体与等量的脂肪酶进行反应，在一定时间内对其固定率进行比较（图1）。

从图1可以看出，利用海藻酸钠包埋法固定脂肪酶的固定率高于其他几种材料。

其随时间增大固定率逐渐降低是由于随着固定时间的增加反应生成的海藻酸钙不断积累，导致酶与底物结合，产物流出逐渐困难，使得固定化酶在单位时间内的酶活降低。

因此，固定率呈逐渐降低趋势，并在6h 趋于平稳。

而其他3种固定材料的固定率在6h 后趋于平稳和小幅回调，说明一定时间后载体的的结合位点达到饱和，而酶与酶之间的聚集也造成了一定的空间阻位，因此出现小幅回调现象。

2.1.2甲醇对固定化酶的酶活力影响。

比较不同载体的固
定化酶和游离酶对甲醇的耐受性，分别隔1、8、24h 取样测定残余酶活。

从表1可以看出，固定化酶在50%的甲醇处理中，在24h 时仍能保持60%以上的酶活力，而在90%的甲醇处理中仍能保持酶活不失。

充分说明了固定化修饰对脂肪酶对甲醇的耐受性有着积极的影响，其中以壳聚糖微球固定化脂肪酶尤为突出。

从图1和表1还可以看出，因为生物柴油的生产中有大量的短链醇存在，所以选择固定率和甲醇耐受力相对较好的壳聚糖微球为载体进行脂肪酶固定化的研究。

2.2固定化条件对酶活力的影响
2.2.1
给酶量对脂肪酶固定化的影响。

考察了不同给酶量
下，脂肪酶的固定化效果。

从图2可以看出，固定化酶活力随着给酶量的增加逐渐增加，在30mg 时达到最高，而后逐渐减少。

造成这种原因可能是载体表面的结合位点随着给酶量的增加逐步达到饱和，而后由于酶量的继续增加，但结合位点不变；大量的酶造成了聚集重叠，降低了部分酶与底物的结合机会，导致产物扩散困难，因而影响了酶的利用率。

2.2.2pH 值对脂肪酶固定化的影响。

考察了不同pH 值下，
pH 值对脂肪酶固定化的影响。

从图3可以看出，随着pH 值
增加，固定化酶活力逐步增大，在pH 值为7.0附近达到最大，随着pH 值的逐步增加，固定化酶活力逐步降低。

由此可知，pH 值为7.0即为脂肪酶固定化的较适pH 值。

2.2.3温度对脂肪酶固定化的影响。

考察了不同温度下，温
度对脂肪酶固定化的影响。

从图4可以看出，固定化温度对酶固定化的活力有显著影响。

低温时分子运动速度慢，从而影响了酶与载体的结合效率。

随着温度的升高，固定化酶活力呈现先升后降的趋势，在温度达到40℃时，固定化酶活力达到最高，后随温度升高活力逐步降低。

因此，本试验的最适反应温度为40℃。

2.3固定化脂肪酶固定强度分析
取0.2g 的固定化酶放入50mL 具塞三角瓶中，并在三
100
20304050607080固定率∥%
2
6
4
8
固定化时间∥h
图1不同材料固定脂肪酶的效率比较
材料
残余酶活∥%
1h 8h 24h
50%甲醇90%甲醇50%甲醇90%甲醇50%甲醇90%甲醇
游离酶81077
0630海藻酸钠8854750690壳聚糖1006893318417大孔树脂974785217712硅藻土965079237110
表1
不同浓度甲醇对固定化酶的酶活力影响
600400
8001000120014001600酶活力∥U /m g
10
给酶量∥mg
图2给酶量对脂肪酶固定化的影响
李明廓等：固定化脂肪酶载体的筛选研究
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农业基础科学
现代农业科技
2012年第5
期
1000800
120014001600酶活力∥U /m g
pH 值
图3
pH 值对脂肪酶固定化的影响
∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥
（上接第23页）
污染物能吸收和散射太阳辐射，削弱了到达地面的太阳辐射，尤其是早、晚太阳高度角较小时，削弱现象更加严重。

4结论
通过分析1960—2010年凤翔县气候资料发现，凤翔县
日照时数的变化呈下降趋势，其气候倾向率为-46.8h/10年。

1966年日照时数最多，为2386.4h ；1989年日照时数最少，仅为1709.2h ，相差677.2h 。

日照时数的年代际变化表现为20世纪80年代以前正距平居多，日照时数偏多，80年代以后多为负距平，日照时数持续偏少。

其中80年代和21世纪以来日照时数最少。

各季日照时数除春季增多外，夏季、秋季和冬季呈减少趋势，尤以夏季减少最强烈，秋季减少最不明显。

各季的变化情况也不尽相同，存在着明显的季
节差异。

影响凤翔日照时数的主要气象因素是云量和降水
日数，但从分析看日照时数的年变化却与总（低）云量和降水日数关系不大。

雾日对日照时数的影响只在秋冬季，且影响较小。

由此说明，凤翔日照时数减少与气象因素关系不大，可能与空气污染有一定关系。

5参考文献
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角瓶中加入蒸馏水20mL ，放入恒温振荡器中，以140r/min 的转速进行洗脱试验。

并分别在不同时间段取样计算固定化酶酶活损失率，计算公式为：
损失率（%）=脱落酶酶活/原固定化酶酶活×100从图5可以看出，随着洗脱时间的增加，固定化酶的损失率逐步升高，在8.0h 后稳定在30%左右，说明固定并不牢靠的脂肪酶已基本脱落完毕，固定化脂肪酶得率稳定，且可以承受生物柴油制备过程中所产生的剪切力。

3结论与讨论
脂肪酶的应用是当今生物工程领域研究的热点之一[9-11]。

本试验对4种酶固定材料进行了固定率和对甲醇的耐受性的分析比较。

发现利用壳聚糖微球固定脂肪酶可以使酶对甲醇的耐受性大大提高，对通过脂合成反应生产生物柴油的研究将会有着积极的影响[12-14]。

并确定了其最适的给酶量为30mg 、固定化时间为8.0h 、pH 值为7.0，固定化温度为40℃，
确定了固定化的机械强度。

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11001000
12001300140015001600酶活力∥U /m g
4045
3530
温度∥℃
图4
温度对脂肪酶固定化的影响
100
203040壳聚糖固定损失率∥%
16.024.0
8.00.5洗脱时间∥h
图5固定化脂肪酶机械固定强度分析
26。