生姜提取蛋白酶

实验二生姜中蛋白酶的提取与分离
一、实验目的
1、初步了解和掌握蛋白质含量测定的原理和方法
2、掌握蛋白酶活力的测定的方法与步骤
3、熟练蛋白酶的提取与分离的基本方法和基本技术
4、学会考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
二、实验原理
生姜(ZingiberofcineiRoscoe)属姜科姜属植物，是一种重要的药食兼用蔬菜，自古被医学家视为药食同源的保健品。

目前，在食品中开发利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等。

生姜蛋白酶是有待开发利用的植物蛋白酶，可用于肉类嫩化、姜汁凝乳、蛋白质水解等方面，开展生姜蛋白酶的研究，可以改变我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状。

生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有机溶剂提取法如丙酮，盐析沉淀法，如硫酸铵沉淀。

这些方法具有提取纯度高的优点，但大都以丙酮粉为酶源，而丙酮粉的制备操作繁琐，消耗大量丙酮，成本高，效率低。

因此，近几年逐步研究了一些新的提取方法。

这些新的方法主要有乙醇沉淀法等。

超滤法具有操作简单，成本低，效率高，无污染，无有害物质残留等特点，非常适合工业化生产。

本研究采用磷酸盐缓冲液(pH6.0)提取粗酶液，再应用硫酸铵盐析，可获得高酶活的生姜蛋白酶，该工艺具有操作简便、成本低、易于产业化等优点，为该酶的工业化生产开辟了一条可能的新途径。

基本工艺流程设计：生姜→洗净→切碎→榨汁→离心除去淀粉→抽滤→超滤（常温，工作压力）→取浓汁→加入乙醇→离心→取沉淀→用缓冲液溶解→离心取上清液加入硫酸铵至40%饱和度→低温静置24小时→离心→取上清→加入硫酸铵至70%饱和度→低温静置24小时→离心→取沉淀→缓冲液溶解→透析→浓缩干燥→部分纯化的生姜蛋白酶粉。

三、材料和试剂
1、材料
生姜，酪蛋白，考马斯亮蓝G-250，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，无水碳酸钠、碳酸氢钠，柠檬酸，硫酸铵、丙酮，酪氨酸，氯化钠，硫酸铵，乙醇，三氯乙酸等
2.仪器
紫外分光光度计，离心机、恒温水浴锅，匀浆机（榨汁机），分析电子天平，真空干燥机
四、溶液的配制（补充步骤）
1、0．01％(w／v)考马斯亮蓝G-250溶液
将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％乙醇中，加入85％正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。

2、0．5％酪蛋白溶液
称取0．5g酪蛋白，先用少量0．55mol/L碳酸钠溶液润湿，
再加少量0．02 mol／L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮
沸溶解，定容至100mL。

3、0.2 mol／L pH7.5的磷酸缓冲液
0.2 mol/L Na2HPO4 84ml +0.2 mol/L NaH2PO4 16ml 混合后加蒸水100ml。

配得0.2 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液。

4、0.05 mol／L pH 6.0的磷酸盐缓冲液
0.05mol/L Na2HPO4 12.3ml +0.05 mol/L NaH2PO4 87.7ml 混合后加蒸水100ml。

五、实验方法与步骤（请补充步骤）
1、蛋白酶的提取（补充，各写出具体过程）
（1）生姜蛋白酶提取液的制备
取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜50 g，切成小块，按料液比1：2加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5），研磨匀浆30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）洗涤后，收集滤液4℃静置2h后，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至100mL（生姜蛋白酶溶液A），4℃冰箱贮存待用。

（2）生姜蛋白酶的提取方法：
丙酮沉淀法或乙醇沉淀法→盐析法→透析
丙酮沉淀法：取生姜蛋白酶溶液A 20 ml，加入1.5倍的4 ℃预冷丙酮进行沉淀，4 ℃静置2 h后，冷冻离心（10000 r/min 5 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶）。

盐析:沉淀用0.05 mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液（20倍）溶解，用四层棉纱布过滤，滤液在4 000 r／min下离心30 min，取上清液调缓慢加入1．2倍(V／V)的冷丙酮轻轻搅拌5 min，4 000 r／min下离心，取沉淀溶于pH 6.0的缓冲液中，缓慢加人硫酸铵至4O% 饱和度，低温静置24h，离心(4 000 r／min)，上清液中继续加入硫酸铵至60% 饱和度，低温静置2 4h，离心取沉淀。

透析：沉淀溶于0．01 mol／L pH 6．0的磷酸盐缓冲溶液中，采用截留分子量14000U的透析袋进行4℃透析，直至l% 氯化钡检查无白色沉淀为止。

浓缩干燥得粗酶粉。

取生姜蛋白酶用pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶解，测定其蛋白酶活力
3、蛋白酶活力的测定
生姜蛋白酶活力的定义：在一定温度（40℃）下，每分钟分解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。

蛋白酶液1.0mL与1.0mL0.5%的酪蛋白混合，40℃水浴下保温反应10min，加入2.0mL0.4mol/L的三氯乙酸终止反应，静置10min 后过滤。

取1.0mL滤液与5.0mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1.0mLFlion-酚试剂混合，40℃下保温发色20min。

对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量三氯乙酸以阻止反应发生。

然后在680nm处，以对照调消光度0（以空白值不加酶液，加1.0ml 蒸馏水，其余同)，测样品的吸光度。

蛋白酶活力的计算：蛋白酶活力单位【U】=OD680nm×K×N
式中：K——1O0除以酪氨酸标准曲线上100mg/ml对应的OD680nm 值，N——酶液稀释倍数
4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）
（1）标准曲线制作：
标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml 蛋白溶液。

分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。

然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。

以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

具体操作见下表:
(2)配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。

取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。

然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。

用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。

在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。

六、结果计算
1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

5）、样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。