杨树综述

杨树抗性基因工程研究进展
林善枝肖基浒张志毅(北京林业大学毛白杨研究所)
摘要杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一，已成为林木基因工程研究的模式植物。

目前在杨树的抗除草剂、抗虫、抗病等生物抗性方面的研究已取得了成功，但在非生物抗性的研究相对较少，该文综述了国内外有关杨树抗性基因工程研究的最新进展，并提出了杨树抗性基因工程育种存在的问题。

关键词杨树抗性基因工程遗传改良
杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一，我国是杨树资源丰富的国家，从新疆到东部沿海，从黑龙江、内蒙古到长江流域均有分布，现已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。

杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强，且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。

但由于杨树具有生长周期长、树体高大等特点，极大地限制了杨树传统育种工作的开展。

也就是说，用常规育种的技术要在短时间内培育出人们所希望的杨树新品种是很困难的，尤其在改良杨树抗性性状方面更加困难。

随着世界人口迅速增长，生态环境破坏的日益加剧，以及地理和气候条件的限制，杨树抗性育种显得更加迫切，已引起国内外林木研究者的普遍关注。

因此查明杨树抗性的生理生化机制及其遗传因素，寻找提高抗性措施，尤其是利用基因工程技术进行杨树抗性育种（包括抗病虫、抗寒冻、抗旱、抗盐碱等），是当代林木分子生物学研究的重要课题之一。

它不仅在基础理论上具有重要意义，在解决生产实际问题上也具有广泛的应用价值。

植物抗性研究已有130多年历史，但林木抗性研究始于20世纪30年代，而真正利用基因工程技术进行杨树抗性育种在20世纪80年代中期才出现。

自从1986年parson等人证实了杨树可以进行遗传转化和外源基因在高等植物细胞中的表达以来，林木基因工程得到了迅速发展，尤其是杨树的基因工程进展最为迅速。

本文对近些年来国内外利用基因工程技术对杨树进行抗性遗传改良研究的现状进行了综述，并对其存在问题及发展前景进行了探讨。

1国外杨树抗性基因工程研究现状
1.1生物抗性方面
1.1.1抗除草剂
fillatti(1987)首先将除草甘膦抗性基因通过根癌农杆菌导入银白杨×大齿杨无性系nc5339中，所获得转基因植株具有抗除草剂效应。

随后又成功地将抗除草剂基因转入美洲黑杨，这是杨树抗性基因工程研究的开端。

1.1.2抗虫
mccabb等(1987)首次将马铃薯胰蛋白酶抑制基因(pin-ⅱ)导入杨树nc5399无性系。

1988～1989年，美国依阿华大学成功地将bt基因和马铃薯中提取的蛋白酶抑制基因(ti)，以根癌农杆菌ti质粒为载体对杨树杂种进行转化并获得杨树抗虫转基因植株。

1991年mcown b.h.等人利用电激法将抗虫bt基因导入银白杨×大齿杨和欧洲黑杨×毛果杨杂种中，均获得抗虫转基因植株。

klopeenstein等(1991，1993)分别将马铃薯创伤反应胰蛋白酶抑制剂基因pin-ⅱ与nos,pin-ⅱ与gus,pin-ⅱ启动子与cat组成的嵌合基因转入杨树nc5399及p.xeuramerimna，并获得抗虫转
基因植株。

1995年法国森林育种实验站gills pilaee领导的研究小组将切割蛋白(protein-cutting)酶基因导入杨树，所得转化植株使食其叶片的昆虫致死率达40%。

1.1.3抗病
在杨树抗病工程的研究中，harvey研究小组(1987)对创伤反应基因在毛果杨×美洲黑杨无性系中表达进行了研究，结果发现杨树创伤反应产生了3种新的转录子mrna，其中转录子win6和win8所编码的几丁质酶可以降解浸染杨树的真菌或细菌的细胞壁，win3转录子所编码的多肽与豆科种子的蛋白酶抑制剂相似具有抑制昆虫的功能。

他们已将win6基因与gus报告基因融合，构建了能在杨树细胞中表达的几丁质酶基因表达系统，用于杨树抗病基因的遗传转化，但尚未有抗真菌病基因转化成功的报道。

1989年rradshaw已从杨树中克隆出了类似于大豆胰蛋白酶抑制剂和几丁质酶的损伤激活基因的cdna并进行了转化研究。

另外，cooper研究小组(1993)成功克隆到杨树花叶病毒的外壳蛋白基因(pmv-cp)并导入杨树，在杨树体内所产生的cp蛋白对杨树pmv的浸染起到一种类似疫学的交叉保护效应。

1.2非生物抗性方面
1996年日本有关报告指出，把来自大肠杆菌的谷胱甘肽还原酶基因导入杂种杨，已培育出抗活性氧的转化体。

1998年arisi等将拟南芥的fe-sod基因导入杨树，增加了转基因杨树的习化能力和耐冻性。

另外，法国inra的lise jouanin实验室已将查尔酮合成酶(chs)基因导入杨树，降低了转基因植株对低温的敏感性。

2国内杨树抗性基因工程研究现状
杨树基因工程育种是林木基因工程研究领域的一个重要部分，它可在体外定向进行基因重组和基因改造，通过相应的载体实现基因转移。

我国利用基因工程技术进行杨树抗性遗传改良起步虽晚，但进步较快，取得了一些可喜成绩。

2.1生物抗性方面
2.1.1抗虫
我国已成功地将抗鳞翅目昆虫的bt毒蛋白用根癌农杆菌导入欧洲黑杨，并获得转基因植株，这使我国在该领域的研究达到了国际先进水平。

中国林科院(1993～1997)成功地将苏云金杆菌bt杀虫蛋白基因导入欧洲黑杨、欧美杨和美洲黑杨，获得对舞毒蛾有毒杀作用的杨树转基因植株，并进入田间试验。

郑均宝等(1995)用含有完全改造的bt抗虫基因表达载体pb48.7和部分改造的bt抗虫基因表达载体pb48.6转雄性毛白杨，获得了转基因植株。

中国科学院微生物所和中国林科院用不同长度的bt基因转化欧洲黑杨获得成功；中科院上海植生所和南京林业大学合作将bt基因和马铃薯的胰蛋白酶抑制基因导入毛白杨和美洲黑杨×小叶杨无性系nl80106，得到了一批转基因植株，目前正在进行分子检测。

1996年中国林科院和北京大学合作开展了抗菌肽lci基因转化杨树的研究，试图培育出一批抗蛀干害虫天牛的转基因植株。

另外，郝贵霞等(1999)已成功将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)导入毛白杨，并获得转基因植株，现已进入大田检测。

2.1.2抗病
1999年赵世民等将兔防御素np-1基因导入毛白杨，结果发现转基因植株组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等多种微生物的生长均有不同程度的抑制作用。

2.2非生物抗性方面 山东农业大学温尚昆等(1997)由根癌农杆菌介导毛白杨导入与抗旱
有关的激素合成基因建立转化系统，获得再生植株。

1994年我国已获得耐盐转基因杨树。

1999年白根本利用mrna差异显示法从胡杨中克隆到几个耐盐基因片段，现已开始进一步筛选和转化杨树的研究。

另外，通过转化山菠菜碱脱氢酶(badh)、磷酸山梨醇脱氢酶(gutd)基因获得耐盐杨树的研究目前也正在进行之中；同时，南京林业大学还与日本合作开展了抗二氧化硫和臭氧污染的转基因杨树研究。

北京林业大学毛白杨研究所现已从耐极端低温(-20℃)的甜杨中诱导出与抗冻性相关的特异蛋白，正着手分离克隆其相关抗冻基因。

3杨树抗性基因工程研究中存在问题
杨树抗性基因工程研究虽然取得了一些突破性进展，但同农作物相比，仍然还处在一个初级阶段，还存在着许多问题有待于去研究解决。

3.1抗性基因工程研究存在局限性
杨树抗性基因工程研究目前仅局限于抗除草剂、抗病和抗食叶害虫等生物抗性，例如ｂt基因植株仅能对鳞翅目的少数虫种产生杀虫效果，各种胰蛋白酶抑制剂基因表达量不够理想。

因此，利用转抗性范围广的双价抗性基因（甚至多价抗性基因）的累加效应是克服上述这些问题的希望所在。

同抗病虫基因工程相比，杨树抗寒冻、抗旱及抗盐碱等抗逆基因工程的研究相对薄弱，至今未见成功报道。

3.2有利于杨树抗性遗传改良的外源基因来源贫乏
目前能有效地利用在林木基因工程中的基因寥寥无几，而这些基因又都是从农作物上引用来的，许多有用的抗性基因还不能识别和分离出来被利用。

已成功地向杨树导入的为数不多的抗病虫及抗除草剂基因大都是来源于细菌(或放线菌)的控制单一性状的简单基因，而杨树需要赋予的性状(如抗寒冻、抗旱及抗盐碱等)大都是多基因控制的，仅靠细菌等少数生物材料提供基因很显然是难以满足的。

因此，要根据林木自身的特点研究发掘适合于杨树抗性提高的主基因，这是解决杨树抗性育种的关键。

3.3抗性基因构建、转化及检测技术需要进一步研究开发
杨树基因组结构存在某些特殊的地方如重复序列多、不易提纯等，使杨树转基因植株的分子生物学检测相对比较困难。

目前常用的天然载体一根癌农杆菌ti质粒虽然能转化杨树，但转化率还很低，即便是已获得了转化细胞，分化再生成植株的过程中还存在着许多困难，这些因素在一定程度上延缓了杨树抗性基因工程研究的进展。

因此进行目的基因构建，寻找更有效的基因载体，进一步完善转化技术和加强分子生物学研究，是提高杨树抗性基因工程成功率的重要方面。

3.4其他问题
从事杨树抗性研究的专业人员缺乏，科研经费不足，技术设备条件落后；在育种目标上仍局限于杨树的速生丰产方面，对杨树的抗性(尤其是非生物抗性)育种重视不够。

因此，今后的杨树遗传改良应在速生丰产和抗性上进行联合改良，特别要加强生物抗性育种转向非生物抗性育种的研究，才有可能不断提高育种水平。

综上所述，植物基因工程技术已在杨树抗性改良中得到了应用，培育出一批具有一定抗除草剂、抗虫、抗病毒能力的转基因植株。

虽然在其实际操作和应用过程中还存在着一些问题，然而随着现代分子遗传学的迅速发展和植物基因工程技术的广泛运用，使一些常规育种技术难以解决的育种问题(抗逆性与抗病虫育种)有可能得到解决，也为杨树抗性的进一步改良提供了依据和机会。

利用植物基因工程技术，可以打破物种间的界线，从各种生物材料中分离提取到有用的抗性基因，通过合适的基因转移技术改良现有的杨树品种，这不仅可以大大缩短育种周期，而且有望提高杨树抗性改良效果。