3.昆虫病原细菌的利用

是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素。通常又被称为：
◦ 伴孢晶体（Parasporal crystal）、
◦ 伴孢晶体包含体（ Parasporal crystal inclusion body） ◦ 晶体蛋白（Crystal protein）、 ◦ 晶体毒素（Crystal toxin）、 ◦ 杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICPs ）

芽孢是细菌的休眠体，对高温、干燥等不良环境条 件有较强的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期 贮存。

பைடு நூலகம்
芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体。
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（二）培养特征

可在多种培养基上生长
菌落：蛋白胨琼脂平板上，30º C培养24小时，形
成针尖状黄色小点，边缘平滑。72小时后，圆盘 状，直径1cm，表面干燥平坦，边缘不整齐，略 显放射状皱纹。
第十七章 昆虫病原细菌的利用 Bacterial entomopathogens
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细菌杀虫剂的特点（筛选生防菌的依据）
（1）有选择性。即对防治对象毒力高，而对植物、
益虫以及哺乳动物等无毒，不污染环境；
（2）稳定性高，易剂型化； （3）致病因子多样化，不易产生抗性； （4）可通过基因工程等手段改造菌株； （5）可结合其它防治手段进行综合管理； （6）可以大规模生产，成本低。
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cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac杀虫毒力最高
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2. 营养期杀虫蛋白VIP

截至2009年，共发现65个vip基因
甲体外毒素（α-exotoxin）
是一种能被热破坏的（120℃，20min）蛋 白质，在菌体培养对数期的后期，先于芽孢和 晶体的形成产生。口服能使某些害虫中毒。
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4、几丁质酶chitinase
可溶性胞外蛋白质类杀虫活性物质 一般作为杀虫剂的增效剂

5、双效菌素ZwA
线形氨基多元醇类化合物 可溶于水，对热敏感 能抑制多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长， 对子囊菌和担子菌也有抑制作用

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6. 免疫抑制因子A 7. 自身诱导物抑制蛋白
8. Bacteriocin-like 抑制因子：细菌素

菌苔：凸突状，乳白色或淡黄色，光滑或有皱纹，
可产生可溶性褐色素
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（三）生理特征

对营养要求不高 碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖 氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆等 无机盐：磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙 温度：27~32°C


pH：略偏碱，7.5
需氧
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（四）生态特征

土壤微生物，分布广（除了南极洲未发现）；
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（二）苏云金杆菌致病机理
B.t.对昆虫的致病作用是通过它所产生的毒素和芽 孢而引起的。
一般是伴孢晶体起作用使昆虫发生毒血症而死亡，即是由于 晶体毒素对中肠上皮细胞作用结果，肠壁受损，中肠的碱性、 高渗内含物进入血腔，血淋巴pH升高从而导致感病幼虫麻 痹死亡。 芽孢的存在不仅可提高Bt.伴孢晶体对昆虫的致病力，芽孢 在肠道中萌发及与菌体一道通过由晶体毒素损坏的中肠肠壁 进入血腔，菌体的繁殖引起昆虫败血症的发生，这也是感病 昆虫死亡的原因之一。
是相同的，其含量也相近，可见不同亚种对昆虫表现
出的不同毒力可能存在于结构单位之中。
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根据杀虫活性和基因同源性分为5类：
cry I：鳞翅目昆虫 cry II：鳞翅目和双翅目昆虫 cry III：鞘翅目昆虫 cry IV：双翅目昆虫 cyt：其它动物，27种基因

Bt Toxin Nomenclature Committee website (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore /Bt/)
•
形态各异：双锥形、球形、立方体型、扁矩形、不规则
形、长菱形
•
杀虫结晶蛋白基因表达产物，基因位于质粒(1~20个)上， 部分在核染色体上，野生菌株一般含有多个编码ICP的基 因
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伴孢晶体的成分
B.t.的伴孢晶体包涵体中含有一或多种杀虫晶体
蛋白，按一定方式聚合成晶体结构， 晶体不溶于水和有机溶剂，可溶于碱性溶液。虽属 热敏感毒素，但具有一定的耐热性，在65℃中可保持 1h，80℃下20 min也不致破坏，80～100℃下30 min 可被破坏。 晶体由18种氨基酸组成，各亚种在氨基酸的组成上

晶体蛋白须在昆虫中肠碱性条件下经蛋白酶的消化作用
裂解为有作用部分和无作用部分，只有有作用的部分或 核心才能算丁体内毒素。
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晶体的形成与芽孢的形成有密切关系。
• •
能抑制芽孢形成的化合物如醋酸氟也能抑制晶体的形成， 特定情况下相对独立。如在低温（14～15℃）培养条件 下不能形成芽孢，但晶体仍能产生。
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Bt晶体毒素引发疾病过程——家蚕

0阶段：0~30 min 停止取食，活动正常，血 淋巴pH和K+上升；


I阶段：轻度迟钝，30~120min，中肠麻痹；
II阶段：极度迟钝，2~3h，不能自主活动； III阶段：全身麻痹，3~4h，心跳完全停止 最后死亡
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1. ICP的致病机理
五环节：昆虫肠道溶解，酶解活化，与受体结合，膜 孔形成，细胞裂解

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一、基本特征
（一） G+的好气性 芽孢杆菌 生活史3个阶段 1. 营养体
以苏云金亚种为例，营养体大小1.2 ～1.8×3.0 ～5.0µ m，两端钝
圆，周生鞭毛，能运动。 营养体横裂生殖，对数生殖期往往2、4、8个或更多的营养体 连在一起成串状。营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩， 出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。
◦ 在土壤优势种影响下，增殖停滞； ◦ 土壤类似于Bt芽孢的存储空间；

在昆虫体内环境下利于其遗传物质交换和增殖；
◦ 有些菌株与寄主形成内共生关系，通过产生抗生物质
帮助寄主抑制病原菌或分泌分解酶助消化；

商用菌株多采自叶面死虫
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（五）感病特征
Type I and II hosts are characterized by a fast onset of gut paralysis continuing in type I to a general paralysis correlating with an increase in the pH and potassium concentration in the hemolymph While both type I and II hosts are susceptible to crystal toxin alone, type III hosts do not develop paralysis and require the presence of spores for mortality.
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苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的 致病性和毒力的差异

苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大。属
于不同血清型的亚种或具有相同血清型的不同亚种 的寄主范围是不同的。

毒力的大小与产生的毒素有关，也与细菌的致病机 制和寄主昆虫的特异性有关。这对工业生产中有效 菌株的选择以及高毒力或其他特异性菌株的选育具 有重要意义。
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第二节 苏云金杆菌
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称B.t.）最 早发现于1901年，1938年世界上第一个苏云金芽孢 杆菌制剂Sporeine在法国问世，1970年初开始商业化 应用。 使用广泛，例如，苏云金杆菌已经成为加拿大控制 枞色卷蛾（spruce budworm）的主要手段。在其它国 家，苏云金杆菌运用于控制毛虫（caterpillar）、舞 毒蛾（gypsy moths）等。 目前，全世界约有苏云金芽孢杆菌杀虫剂100多个品 种，年销售额近1亿美元。
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第一节 昆虫病原细菌的主要类群
一般生物学特征：

真细菌：G+，G，支原体；主要集中在芽孢杆菌科、 类芽孢杆菌科、肠杆菌科、奈瑟菌科等；


三阶段：延滞期、指数生长、静止期
亚种、菌株差异 致病相关基因以基因族形式存在，毒素基因大多在 质粒上
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感染、致病和传播

从口部进入：突破障碍（口部唾液、肠道围 食膜、肠道菌群）

有些种类能产生毒素，如引起细菌性中毒病的苏云 金杆菌以及能引起灵菌败血病的粘质沙雷氏菌等。
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三、潜在病原菌（Potential entomopathogenic bacteria ）

多数为腐生菌，普遍存在于昆虫的消化道中。如铜 绿假单胞菌

由于毒素和酶的产生数量少，难以侵入体腔内给宿
主造成危害。 作为寄主的昆虫种类很多，不是特定昆虫种的病原 体。 能引起家蚕细菌性败血病和细菌性肠道病的一些细 菌便属于这一类。
1)当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后，在中肠肠液碱性条 件下打开二硫键溶解成原毒素，
2)进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片
断（toxic core fragment）， 3)才能与刷状缘（brush border）上特异性受体高亲和性地结合， 4)快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔或损伤（lesion），并破 坏钾、钠离子梯度，引起膜的非极性化， 5) 细胞裂解，昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡。
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2. 芽孢囊期


在形成芽孢的同时，在菌体内的一端或两端能形成 具蛋白质性质的一个、两个乃至多个菱形、方形、 长方形、椭圆形、镶嵌形或不规则形的伴孢晶体， 是其主要的活性成分。 伴孢晶体由不同分子量的多肽——原毒素（protoxin） 组成。
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3. 芽孢和伴孢晶体的释放

芽孢囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢 （0.8~0.9µ m2.0µ m）和伴孢晶体（0.6µ m 2.0µ m ）。
如天幕毛虫芽孢杆菌Clostridium malacosomae
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二、兼性病原细菌（Facultative entomopathogenic bacteria ）

一类可在人工培养基上正常生长发育的细菌。包括
产芽孢和不产孢的杆菌。如蜡状芽孢杆菌

寄主范围较广。 细菌在寄主消化道内增殖，并侵入体腔内，造成寄 主染病死亡。
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昆虫病原细菌的主要类群:

芽孢杆菌属（Bacillus）: Bt；金龟子芽孢杆菌；球形 芽孢杆菌 梭状芽孢杆菌属（Clostridium）：天幕虫梭菌 假单胞菌属（Pseudomonas）：铜绿假单胞菌 赛氏杆菌属（Serratia）：灵杆菌 变形杆菌属（Proteus） 肠杆菌属（Enterobacter） 沙门氏菌属（Salmonella） 葡萄球菌属（Staphylococcus）

引发毒血症和败血症 早期症状：停止取食、麻痹、腹泻、呕吐等 后期症状：组织坏死、体色变化、虫体变软 变形、有恶臭液体流出
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根据昆虫病原细菌的特性和致病所需条件可分为：
一、专性病原细菌

Obligate entomopathogenic bacteria 经口部至消化道感染


专化性高，难以人工培养
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三、苏云金杆菌的毒素和致病机理
（一） 苏云金杆菌的毒素
苏云金杆菌产生的毒素分为两大类：一类是内毒 素，即伴孢晶体内所含毒素；另一类是外毒素，是 细菌在生长过程中分泌在菌体外的代谢产物。苏云 金杆菌所产生的毒素主要是β外毒素和δ内毒素。
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1. 杀虫晶体蛋白——丁体内毒素（δendotoxin）
3.乙体外毒素（ β-exotoxin）
又称苏云金素、热稳定外毒素、蝇毒素，能 忍耐121℃(15min)的高温和对家蝇幼虫有毒 性。 β外毒素是一种腺嘌呤核苷酸衍生物，相对 分子量约为700，它是苏云金芽孢杆菌在一 定培养条件下所产生的细胞外毒素，可溶于 水， 苏云金素是广谱毒素，对较多目的昆虫有毒 性。
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How do Cry toxins work?
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ICP杀虫特异性与跟受体亲和力大小有关 抗性的形成 关于细胞裂解两种假说： ◦ 质子崩溃假说 ◦ 渗透裂解假说

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二、类群分类
到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋 白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的 3000种有害生物有活性。
根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性，
苏云金芽孢杆菌可划分为71个血清型86个亚种。
鞭毛抗原血清型（H-血清型，H亚因子）：国际咨询中 心编号 酯酶型：无鞭毛菌株