显微镜自动对焦系统设计与应用

[2]．刘义鹏《显微镜自动对焦系统设计与应用》
自动对焦技术越来越多的应用于各种成像系统,无论是在日常生活、科学研究、军事应用等等只要涉及到成像系统的地方都有重要应用.目前,自动对焦技术的各种理论和方法发展很快,然而,其在一些成像系统中的实际应用并不成熟,仍需要进行大量的研究.实用自动对焦系统的设计包括对焦评价函数、控制系统、执行机构、电源和用户界面等方面的设计.本文在以往自动对焦方面工作的基础上,设计了一种应用在显微镜中的自动对焦系统.此系统基于单片机控制和CCD模拟视频信号处理.系统通过对CCD输出的模拟视频信号进行滤波,提取出代表图像清晰程度的高频成分,并以此作为对焦评价值,由单片机控制对焦过程,驱动执行机构完成对焦.测试结果显示,系统对焦结果的稳定性和对焦时间都很好满足了设计要求.此系统的特点是结构简单、对焦速度快、对焦结果稳定、成本低,因此实用性极强.本文包含了以下一些内容:(1)介绍了自动对焦技术的现状、原理和方法.(2)设计出一种基于视频信号模拟滤波的对焦评价方法.(3)设计实现了基于视频信号滤波和单片机控制的显微镜自动对焦系统硬件结构.(4)设计了此显微镜自动对焦系统的软件部分.(5)对此显微镜自动对焦系统性能进行了详细测试.(6)最后,本文对自动对焦技术在显微成像系统中的应用进行了展望,分析了今后需要研究的方向.本文在理论分析的基础上,着重进行了工程设计和实现,将自动对焦的相关理论应用于显微镜系统,并结合实际需求,设计出稳定、实用的系统.
1. 2自动对焦技术现状
自动对焦技术于20世纪70年代最初应用于照相系统。

传统的对焦技术大部分是基于测距原理的1，如超声波测距法、反射能量法2,3和一些基于三角测距原理的方法4。

随着电子技术和信号处理技术的发展，产生了基于视频信号分析的自动对焦技术，并应用于摄像系统5,6。

进入20世纪90年代，以CCD获取图像借助于图像分析与处理的对焦方法得到了发展。

国际上自动对焦技术比较成熟，特别是应用在数字照相机、监控系统方面，但也存在一定的局限性，甚至有误对焦等情况的出现7，而应用在显微镜上的自动对焦相对较少，Nikon 公司已经推出了这方面的产品，但价格比较昂贵。

在自动对焦技术领域的研究中，人们提出了多种多样的自动对焦评价方法。

文献8提出了一种基于嫡函数的自动对焦方法;文献9提出了基于能量和嫡的对焦评价方法;文献10提出了一种基于小波变换的多分辨率分析方法来实现数字图像自动聚焦的新算法;文献11提出了一种基于图像清晰度的自动聚焦算法。

文献12提出了一种基于尺度变化的DCT自动聚焦算法。

浙江大学对数字成像系统的自动对焦技术进行了研究。

在图像非均匀采样’3、图像预处理’14、自动对焦区域设计15、自动对焦评价函数方面进行了深入研究，提出了基于分辨力空间变化16、基于彩色图像RGB分析17、基于频谱分析的离焦深度等的自动对焦法18，以及用于数码相机系统中的瞳孔控制自动对焦技术19；基于皮肤探测的自动对焦技术20;并设计了几种用于数字成像的自动对焦系统21.22
华中科技大学的杨少波等对曲面成像的自动聚焦方法进行了研究23，浙江科技学院的郑玉珍等人研究了实时自动对焦技术24。

目前，自动对焦技术在数码相机/摄像机中得到了普遍应用，也在投影系统25、红外成像系统26、显微成像系统27,28,29,30中得到了应用。

文献27, 28, 29,30对自动对焦技术在显微成像系统方面的应用进行了一些研究。

文献27讨论了适用于显微系统自动对焦的几种实用对焦评价函数。

文献28, 29通过CCD采集视频信号，由PC机作为运算控制中心，文献28采用图像的灰度差分绝对值之和算子作为评价函数，文献29采用八邻点平方差之和作为评价函数。

文献30设计了基于视频信号模拟滤波和单片机控制的自动对焦系统。

本硕士学位论文的具体内容如下:
第一章介绍了课题的研究意义、自动对焦技术现状，确定本论文的研究内容。

第二章探讨了自动对焦技术的原理和方法。

第三章设计了一种基于CCD 视频信号处理与单片机控制的显微镜自动对焦系统。

结合显微镜的原理与特点，设计出系统方案和各个部分硬件结构，包括模拟信号处理、单片机控制于A/D 部分数据采集、执行机构。

最后给出系统实物图。

第四章为软件设计。

介绍了对焦评价函数的设计，对爬山搜索算法进行了改进，并设计出系统运行流程图和各部分子程序。

第五章为实验和系统精度分析。

实验部分包括对焦曲线测试、滤波器通带选择、步长选择、搜索算法实验、执行机构空回测试、系统稳定性测试、系统对焦时间测试:精度分析对系统对焦精度进行了估算。

第六章总结了全文的研究内容，并对课题的后续研究进行展望。

第二章 自动对焦的原理和方法
图2-1显示了光学成像的基本原理。

理想成像时有
f
v u 111=+ （2-1）
聚焦时，物体上的一个点在成像平面上聚成一个点，此时的成像平面又称为聚焦平面。

若成像平面距镜头的距离不是v 而是s ，那么该物体点在成像平面上不是聚成一个点，而是扩散成具有半径为舶勺圆形光斑，这样图像就变得模糊。

成像平面距聚焦平面的距离:一v 越大，散焦程度越大，R 也就越大，图像就越模糊。

可用式2一2表示:
()
u s f D s R 1112--= （2一2） 理想成像系统的点扩展函数PSF (Point Spread Function)()y x h ,可以用式(2-3)表示:
()⎰⎰∞∞-∞
∞-=1,dxdy y x h （2-3） 在非相干光源下，圆形孔径的点扩散函数为：
()()21112,⎥⎦⎤⎢⎣
⎡=z z J y x h （2-4） 式中1J 是一阶贝塞尔函数，fr
D z λπ=1，D 为物镜入瞳直径，f 为物镜焦距，λ为窄带非相干光源的中心波长，r 为像面内距中心距离（22y x r +=
）。

由于贝塞尔函数比较复杂，在实际应用中常用二维高斯函数来近似表示此时的点扩散函数：
()2222/)(221,a y x e a y x h +-=π （2-5）
式中a 为点扩散函数分布的标准偏差的扩散参量，它与模糊半径成正比
CR a = （2-6）
则光学传递函数（Optical Transfer Function ）为：
()()[]
222
1,exp ,a v v H ωρω-= （2-7） 光学传递函数反映成像系统对物体不同频率成分的传递能力。

其传递效果是频率不变但对比度下降，相位发生推移，并在某一频率处截止，即对比度为零。

根据以上分析可知，光学成像系统等价于一个低通滤波器，不同的离焦情况下滤波器对应的截止频率不同。

对焦愈准确，截止频率愈高；离焦量愈大，则截止频率愈低。

此时空域上表现为点光源成像后形成的一定大小的模糊圆，相邻的像素相互影像，频域上表现为高频分量流失造成的图像细节模糊。

所谓自动对焦，就是用某种手段使光学成像系统成像时进行自动调节使图像探测器位于理想成像位置上。

随着现代成像系统逐渐向智能化的方向发展，自动对焦技术已成为成像系统中必不可少的一个部分。

2.2自动对焦的基本方法
2. 2. 1传统的对焦技术
1.像偏移法
像偏移法利用三角测距原理，由被摄物体发出的光线，同时进入测距器的左、右两端，并成像在接收元件上，通过两组间的信号比较，求得合适的对焦位
2. PSD 测距法
PSD 测距系统是另一种基于三角测距原理的自动对焦技术31。

红外发光管经准直透镜向被摄目标发射红外辐射，用接受透镜收集经物体漫反射后的辐射，并会聚在位置检测器件PSD 上。

通过对PSD 输出电流比值的探测和运算得到被测物体的物距，从而通过镜头控制系统达到自动对焦的目的。

3.对比度法
当系统对焦时，图像对比度最强；系统离焦时，图像对比度下降，离焦量越大，对比度越低。

因此，可以通过一维CCD 作对比度检测，根据检测结果判别是否对焦，并对离焦情况进行对焦处理。

2.2.2视频信号分析法
前述的对焦方法一般用于传统的照相系统，随着新一代成像器件CCD的出现，自动对焦所需要的信息也越来越丰富。

对于对焦准确的图像，画面清晰，轮廓清楚，图像高频成分的电平幅度大;离焦时，画面不清晰，轮廓不清楚，高频成分的电平幅度小.视频信号分析法采用图2-2所示的结构分析信号成分。

视频信号分析法通对CCD输出的视频信号的高、中、低频分量进行测试分析，根据不同离焦程度时各频率成分的变化来判断是否对焦，并驱动镜头或CCD实现对焦。

视频信号分析法的特点是运算量小，实现简单，用单片机系统即可实现分析于控制30,32，在一些摄像系统中广泛应用。

2.2.3基于数字图像处理的对焦方法
在数字成像系统中，可以通过数字图像处理的方式实现自动对焦。

基于数字图像处理的对焦方法分为两大类:对焦深度法和离焦深度法33
1.对焦深度法
对焦深度法简称DFF (Depth from Focus)，是一种建立在搜寻过程上的对焦方式。

它通过一系列对焦逐渐准确的图像来确定物点至成像系统的距离。

这个搜寻过程需要不同成像参数下的多幅图像，所用图像越多则对焦精度越高。

理想的对焦评价函数要求是单峰值，单调的，在最佳对焦位置获得最大值。

为了能够准确地探测峰值的位置，减少由于噪声产生的局部极大值己经边缘凸出效应的干扰，可以使用Fibonacci搜寻法以及高斯曲线拟合法34
2.离焦深度法
离焦深度法简称DFD (Depth from Defocus)，与DFF不同的是，是一种从离焦图像中取得深度信息从而完成自动对焦的方法。

这种方法只需要获得2-3幅的不同成像参数下的图像，就可以完成自动对焦过程35,36，37。

这种方法要求事先用数学模型描述成像系统，然后根据少量的成像位置获取的图像来计算最佳对焦位置。

因为计算所需要图像数少，大大减少了驱动电机等机械结构所需要时间，所以离焦深度法快，但是对焦精度不及DFF方法高。

DFD 方法主要有两类。

其一是Sang Ku Kim等人提出的基于图像恢复的离焦深度法，根据图像中的某些有代表性的信息来计算出成像系统的点扩散函数，利用图像的退化模型，反演计算出模糊图像的原图38。

这种方法的关键在于从图像中获取一定的有代表性的信息，因为它并不是基于任意目标物体的，有一定局限性。

例如:Sang Ku Kim等人提出的方法就要求被恢复图像中有较明显的边缘信息。

另一类是基于模糊程度(弥散斑的大小)分析的方法39,40根据几何光学的原理可以找到弥散斑大小与镜头成像参数之间的关系，从而计算出最佳成像位置。

第三章显微镜自动对焦系统硬件设计
3. 1显微镜原理
显微镜在生物研究、工业分析等方面有着非常重要的用途。

它是比较复杂的共轴光学系统。

主要由光源、孔径光栏、聚光镜、物镜和目镜等部分构成
3. 1.，显微镜的成像原理
显微镜首先通过短焦距的物镜对物体成像，然后再通过长焦距的目镜将物像放大并投影到屏幕(包括人类视网膜)上。

其成像原理如图3-1所示41
图3-1显微镜成像原理
3.1.2显微镜的景深
人眼通过显微镜调焦在某一平面(对准平面)上时，在对准平面前和后一定范围内物体也能清晰成像，能清晰成像的远、近物平面之间的距离称作显微镜的景深。

研究成像系统的景深对自动对焦系统设计非常重要。

关于显微镜系统的景深，许多人给出了不同的计算公式。

虽然大家的意见都不完全相同，却都认为景深应该和光波长λ、显微镜物镜数值孔径NA 、介质折射率n 和显微镜放大率M
这几个参数相关。

其中两个最著名的公式是Born&Wolf 提出的公式41 (3-1)和
Piller 提出的公式42 (3-2).
()2*2/NA Z λ= (3一1)
()
()M NA NA Z **7/1000*2/2+=λ (3一2)
I.T. Young 等指出上述公式在高数值孔径、衍射受限系统中与实验相差较大，并结合理论和实验给出了如下的经验公式43 ()⎪⎭⎫ ⎝⎛--=2/114n NA n Z λ
(3-3)
根据(3-1), (3-1), (3-1)式对本系统所用显微镜的景深进行了计算，计算
结果如表3-1所示。

从表中可看出随着物镜数值孔径的增大，景深变小，各物镜下的景深从不足
一个微米到几十个微米不等。

3.1.3显微镜的齐焦差
在显微镜一个镜头已对焦的情况下，更换物镜观察时，理论上不需要重新对
焦，生产厂商已对各个镜头进行了齐焦。

然而，各镜头之间难免存在齐焦差，《中
华人民共和国国家标准GB/T 2985-1999生物显微镜》44对齐焦差允许范围进行
了规定，如表3-2所示。

3.2系统方案
由第二章分析可知，光学成像系统可以看作一个低通滤波器，成像系统存在一个截止频率，在截止频率以上的信息经光学系统成像后将丢失掉，截止频率一下的成分被光学系统进行调制和传递。

成像系统高频输出量和系统离焦量成反比。

系统聚焦时，输出图像的高频成分最多，也即图像的细节最多；当系统离焦时，系统的光学传递函数变差，高频成分损失，离焦量越大，高频成分损失越多，图像越不清晰。

据此，本文设计了一种基于视频图像高频成分判别的自动对焦系统，如图3-1所示。

本系统包括光学系统，CCD视频信号获取，模拟视频信号处理，单片机控制与对焦执行机构五个部分。

其中光学系统和CCD负责视频信号的获取；模拟信号处理部分对获得的视频信号滤波，保留高频成分，并对一帧图像中高频信号积分；单片机通过A/D器件采集积分信
号，据此判断是否处于最佳对焦位置，并根据一定的搜索算法控制执行机构进行对焦。

3. 3 CCD 与视频信号
13. 1 CCD 成像器件
电荷藕合器件CCD (Charge Coupled Device)是20世纪70年代新发展起来的集成半导体器件。

由CCD 构成的图像传感器是一种具有自扫描功能的摄像器件。

它与传统的电子束扫描真空摄像管相比，具有体积小重量轻，使用电压低(<20V)可靠性高和不需要强光照明等优点，因此在军用、工业控制与检测、民用电器中均有广泛应用。

CCD 是一种成像光电器件，用集成电路工艺制成。

它以电荷包的形式存储和传送信息，主要由光敏单元、输入结构和输出结构等部分组成。

CCD 有面阵和线阵之分，光敏元排列为一行的成为线阵CCD ，像元数从128, 5000至几万不等构成一个产品系列。

面阵CCD 器件像元排列为一平面，包含若干行和列的结合。

目前达到实用阶段的像元数由25万至数千万不等(绝大多数在30万-500万之间)；按接受光面积尺寸的不同有1/4英寸、1/3英寸、1/2英寸、2/3英寸、1英寸之分；按使用场合的不同有彩色和黑白CCD 之别。

无论线阵CCD ，还是面阵CCD ，工作原理基本相同33
CCD 作为成像光电器件，其输出模拟视频信号，也就是全电视信号。

3.3.2视频信号的形成
在电视图像信号(即视频信号)中，景物亮度B 是空间坐标x, y,z 和时间t 的四维函数，即
()t z y x f B ,,,= (3-2)
上式为立体图像信号表达式。

对平面图像而言由
()t y x f B ,,= (3-3)
因为任一平面均为无穷个点的集合，对任一时刻0t , ()0,,t y x f B =都拥有无限大的信息量。

仿“传真”技术，将平面图像分解成若干个小面积之和。

当这些小面积小到一定程度时，由于人眼分辨黑白细节的能力是有限的，故在人眼看来是一个点。

它们成为组成图像的基本元素，称之为像素，用这些像素的亮度变化，代替整幅图像的亮度变化，这实质是对图像信息的空间抽样，将图像信息从无限变成有限。

我国电视制式，一幅电视图像约包含48万个像素，视频的传输采用顺序传送。

平面图像被分割为像素后，式(3-3)也即为像素的亮度方程。

此方程表示平面x, y 处的亮度随时间变化。

而要进行传输，还必须将光信号变换为电信号。

图像信号的光电变换由摄像管或CCD, CMOS 等光电成像器件完成。

客观景物连续变化，任一瞬间都是一幅图像，在一段时间间隔内是无穷维的。

实际视频传输是采用离散的图像序列来传送的，由于人眼的视觉惰性，只要传输的帧率(每秒钟传输的图像帧数)大于某个数值，人眼就感觉不出图像的间断。

研究表明，人眼的视觉暂留时间(亮度消失时间)大约在0.1秒左右。

这表示，只要每幅图像出现时间小于0.1秒，眼睛在感觉后一幅图像时，对前一幅图像的印象虽然己经减弱，却不能完全消失，这样，眼睛将产生图像获动的感觉。

要使图像的活动连续变化、没有跳动的感觉。

根据经验，每秒出现的图像应在24幅以上，我国电视采用的标准是每秒25帧45
3.3.3黑白全电视信号(视频信号)
全电视信号包括图像信号、行消隐信号、行同步信号、场消隐信号、场同步信号和前、后均衡脉冲，共七种信号。

其中图像信号为图像传送期，同步信号保证频率和相位的一致，消隐信号提供黑色电平，避免回程期内出现亮线，干扰图像信号，均衡脉冲则避免了并行现象。

我国电视标准规定帧频为25hz ，即每秒传送25帧。

一帧图像包括625行，除去回扫的50行，实际为575行。

每行周期为64us ，扫描正程52us ，扫描回程12us ，在正程的52us 时间内获得一行图像信号。

图像信号是单值的。

规定图像信号高电平75%处对应于图像黑色‘称为黑色电平:图像信号低电平10%处对应于图像白色，称为白色电平，则此图像信号称为负极性信号。

反之，规定图像信号低电平10%对应于图像黑色，称为黑色电平;图像信号高电平75%对应于图像白色，称为白色电平，则此种图像信号称为正极性信号。

我国电视标准给出正极 性信号波形，同时又规定图像发送采用负极性调幅，送给显像管的图像信号通常
也采用负极性信号。

全电视信号中一帧图像625行，由奇数场和偶数场组成，奇数场和偶数场全电视信号如图3-2所示45,46
3.4模拟信号处理
3.4. 1信号滤波
由第二章知，图像的细节和清晰度有关，离焦的图像，丧失掉部分细节，在频域上表现为高频信号的减弱。

离焦量愈大，图像愈不清晰，信号的高频部分愈弱。

从而，我们可以根据视频信号的高频成分判断图像是否对焦，以及离焦程度，只要找到了包含高频成分最多的那帧图像，对应的成像位置即可认为是最近对焦位置。

视频信号的带宽为6MHz ，传输的信号中更高的频率成分则为无效的噪音信号。

为此，需要设计一个能让图像中高频部分通过，而有虑掉噪声的滤波器。

设置相应参数的带通滤波器可以完成这个功能。

滤波器是一种选频装置，它允许输入信号中的特定频率成分通过，同时抑制或极大地衰减其它频率成分。

滤波器的传输函数定义为其输出信号频谱()ωj V 1与其输入信号频谱()ωj V 2之比式中
()()()
()()ωϕωωωωj e K j V j V j H ==12(3-4) ()ωK 一一幅频特性或幅频响应:
()ωϕ一一相频特性或相频响应。

实际可实现的滤波器传输函数是一个有理函数
()a
s a s a s b s b s b s b S H n n n m m m m +++++++=----11111110...... (3-5) 式中，a, b 为实常数，ωj S =,n 为滤波器的阶。

滤波器按其阶次可分为一阶滤波器、二阶滤波器、三阶滤波器⋯
二阶滤波器
()2
02212020221202122120/2a Q S S b S b S b a S D S b S b S b a S a S b S b S b S H ++++=++++=++++=ωω (3-6)
式中 D 一阻尼系数(212/a a D =)；
Q 一品质因数(121/2/1a a D Q ==-)；
0ω一固有频率或自然频率(20a =ω)。

滤波器按组成电路可分为有源滤波器和无源滤波器两大类。

无源滤波器是指单纯用无源器件，如电感、电容和电阻组成的LC 滤波器或RC 滤波器。

有源滤波器是指用有源器件和电阻、电容组成的滤波器，有源滤波器中的有源器件可以用晶体管，也可用运算放大器，特别是由运算放大器组成的有源RC 滤波器可以做到体积小，重量轻，损耗小，并且可以提供一定的增益，还可以起到缓冲的作用，因此得到了广泛的应用。