《基因克隆的策略》PPT课件

反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉， 这样一个5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个3 ′端保护 了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。 如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到150-200bp的长度，
2、从基因组文库中钓取
因为基因组DNA片段是随即克隆的，所以基因组大小除 以克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角度 分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有 50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特定DNA 片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的几率以克 隆到目的基因，一个完整的基因组文库就必须含有3-10
《基因工程概论》
第一章 导 论
第二章 基因操作的工具酶
第三章 基因克隆的载体
第四章 基因克隆的策略
第五章 克隆基因的表达
第六章 基因工程的基本技术
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
引
言
基因克隆的本质是把某一目标DNA片段通过无性 的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体 和寄主细胞来实现的。
2、从基因组文库中钓取目的基因
BamHI
1981年Ish-Horowics 和Burke设计的特殊的 基因组克隆方案，选用 MboI或Sau3A进行基因 组DNA的酶切。不仅是 因为它们是4碱基识别 位点的酶，而且它们和 BamHI是同尾酶。
HindIII cos Sal I
126 542 81 162 453
1978 1979 1981 1982 1982 1984
ห้องสมุดไป่ตู้
1、化学法直接合成基因
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成
首先，将一个5′端保护了的核苷酸和另一个3 ′端保护了的核 苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 为了定向形成5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应 的基团保护起来。
1、化学法直接合成基因
基因的组装过程
方法1
ligase
方法1
Klenow fragments
MCS
第一节 目的DNA片段的获得
1、化学法直接合成 2、从基因组文库中钓取 3、从cDNA文库中钓取 4、通过PCR直接扩增
2、从基因组文库中钓取
基因文库（gene library）是指汇集了某一生物基因组 DNA全部序列的重组体DNA群体（转化子群）。 基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基 因组本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有关。
一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目标 DNA片段的获得；2、克隆载体的构建；3、寄主细胞 的转化；4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为 载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种 克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。
大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案
倍于最低重组克隆数的克隆。
1975年，L. Clarke和J. Carbon提出了一个计算完全基因 组文库所需实际克隆数的公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中，N代 表实际克隆数；p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一 般的期望值都为99%）；f代表限制性片段的平均大小与相应 生物体基因组大小的比值。
早期通过化学合成的部分基因
基因 大小（bp） 合成年代 基因 视紫红质 前脑菲肽 ATP酶 溶菌酶 RNA酶T1 RNA酶Ａ 大小（bp） 合成年代 1057 77 1985 170 1985 385 1985 324 1985 375 1986 1987
人胰岛素 转运RNA -干扰素 肠促胰液肽 尿抑胃激素 -干扰素
DNA片段 的获得 限制性内 切酶消化 机械切割 双链cDNA 的合成 化学法 直接合成
载体构建
同聚物 加尾
粘性末端 连接
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切鉴定
第四章
引 言
基因克隆的策略
第一节 目的基因的获得
第二节 重组体的构建及细菌转化 第三节 重组克隆的筛选和鉴定
第一节 目的DNA片段的获得
1、化学法直接合成基因 2、从基因组文库中钓取目的基因 3、从cDNA文库中钓取目的基因 4、通过PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因
所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以 只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。 1977年，K. Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的 基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的 表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。
而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将 寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡 核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。
基因组装常用的有两种方法：一种方法是先将寡核苷酸 片段激活，带上5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段 退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶 将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。第二种 方法是将两条具有3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产 生的单链区段可在Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸， 这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便 可得到合成的基因片段。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数 5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386