闵少颖-微生物细胞表面展示技术
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微生物细胞表面展示在生物除污方面的应用
百度文库
闵少颖 10708057
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引言 细胞表面展示系统的应用 几种不同的细胞表面展示系统 总结与前景展望
1 引言：利用重组DNA技术将不同蛋白展示在微生物细胞表
面作为一种新的生物除污方法已经出现，并且已经研究了细 菌和酵母在这方面的应用。细胞表面展示的特定蛋白使工程 微生物能够转运、生物聚集重金属或使重金属解毒，也能降 解外源性化学物质。本文介绍了微生物细胞表面展示技术在 通过金属结合蛋白增强重金属的生物聚集方面的应用，同时 也讨论了通过酶或微生物细胞表面的蛋白降解外源性化学物 质。
2.2 细胞表面展示增强外源性化学物质的生物降解作用
有机磷农药是目前使用最广泛的农药, 占农药总量的80% ,也 是毒害最大的农药之一,是一种神经毒素,可引起乙酰胆碱积累, 干扰肌肉反应. 从土壤微生物中分离的有机磷水解酶(OPH)能 有效地降解有机磷农药,降低其毒性,如对硫磷和甲基对硫磷经 OPH水解后毒性降120倍. 但是,用分离纯化的OPH来消除环 境中有机磷农药的毒性显然是不现实的,用整细胞进行污染物 脱毒费用也很高,而且有机磷难以透过细胞膜,效率很低. Richins等研究表明,表面展示OPH的工程菌降解对硫磷和对 氧磷的速度是胞内表达OPH菌株的7倍,而且比纯化的OPH更 稳定.
尽管酶水解能使对硫磷和甲基对硫磷等有机磷农药的毒性 下降120 倍,但其降解产物P - 硝基苯酚（PNP)仍被认为是 环境污染物. PNP不像有机磷农药,它在水中的溶解度很高. Spain和Gibson发现摩拉克氏菌能以PNP为唯一碳源,具有 降解PNP的能力. Shimazu 等通过INP将OPH展示在摩拉克 氏菌细胞表面,使单一工程菌具备同时降解有机磷农药和 PNP的能力,工程菌降解甲基对硫磷和对硫磷的速率分别为0. 6μmol h-1 mg-1和1. 5μmol h- 1 mg- 1 ,约比野生菌高10倍,工 程菌降解PNP的速率与野生菌相同.
植物螯合素( PCs)是植物和真菌中天然存在的金属结合肽, 含(Glu - Cys) 2 - 11 Gly结构,其金属结合能力比金属硫蛋白 强,Bae等将合成的PCs展示在摩氏杆菌细胞表面,重组菌与 汞的结合能力增强10倍.金属结合短肽、金属硫蛋白、 PCs结合金属离子的选择性较差,难以满足特殊要求. 其实 自然界存在许多有高度专一性的金属结合蛋白,许多细菌 可经诱导产生代谢和失活重金属毒性的运输蛋白和酶,例 如最近Bae等把金属调控蛋白(MerR)与冰晶蛋白（NP） 融合,使MerR展示在大肠杆菌细胞表面,这样得到的重组菌, 其Hg2+结合能力比野生型大肠杆菌JM109高出6倍. 而且, 对Hg2+有很强的专一性,对离子农度、pH值和金属螯合剂 不敏感,在超出Hg2+浓度100倍的Cd2+和Zn2+存在的情况下, 重组菌对Hg2+的吸附没有明显的减弱.
微生物表面展示技术是一种新的基因工程技术, 它使表达 的外源肽以融合蛋白形式展示在噬菌体或微生物细胞的表 面, 被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构 和生物活性。随着展示技术的发展, 人们可以更有效的认 识、改造和创建各种生物大分子。改造细胞表面结构, 比 改造细胞其他部位结构更容易实现, 因此也就更接近实际 应用。通过表面展示技术制备细胞表面吸附剂, 可在重金 属污染去除和毒性有机污染物的脱毒等环境保护领域以及 生物传感器和金属溶出等方面得到应用。微生物细胞表面 展示技术还可以应用于开发活的细菌疫苗、筛选抗体库、 生产生物细胞吸附剂以及制备整细胞生物催化剂。通过金 属高效结合肽的肽库筛选和微生物展示技术，将金属结合 肽直接展示在微生物的表面，用于处理环境中的重金属污 染，为环境中重金属污染的防治提供了一条新的途径。
3.1革兰氏阴性菌表面展示系统
革兰氏阴性菌展示系统的宿主细胞主要是大肠杆菌，载体 蛋白大部分都是利用外膜蛋白开发的。革兰氏阴性细菌展 示系统中主要应用N端融合，C端融合，插入融合三种融 合方法。
将酵母和哺乳动物的金属硫蛋白(metellothioneins,MTs)展 示在大肠杆菌细胞表面也已有不少成功的例子金属硫蛋白 富含半胱氨酸,能结合金属离子使其失活. Sousa等将酵母 和哺乳动物的金属硫蛋白与LamB融合,并表达展示在大肠 杆菌细胞表面,重组菌结合Cd2+的能力增强15～20倍,Valls 等和Kotrba等报道了类似的试验结果. 但是这类重组菌不 适用与原位土壤修复. 假单孢菌( Pseudom onas) 具有旺 盛生长能力、能在高度污染的环境中生长,具有生物修复 应用的潜力.Valls等将小鼠MTs与奈瑟氏球菌(N eisseria) IgA蛋白酶β- 结构域融合,并在恶臭假单孢杆菌( P. putita) 中表达,结果重组菌的重金属结合能力增强3倍.
2.1细胞表面展示增强重金属的生物富集
将富含组氨酸和半胱氨酸金属结合短肽通过与膜蛋白OmpC和 麦芽糖孔蛋白（ LamB ） 融合展示在细胞表面的研究已有许 多报道。Sousa等将六聚组氨酸通过LamB 展示在大肠杆菌表 面,重组菌对Cd2+的吸附和富集能力增加10倍,不过这种工程菌 对重金属的吸附缺乏专一性,除吸附Cd2+外,还可结合Zn2+ 、 Cu2+ 、Ni2+等. Kotrba等将Gly - His - His - Pro- His - Gly (用 HP表示)和Gly - Cys - Gly - Cys - Pro - Cys -Gly - Cys - Gly (用CP表示)分别与LamB融合展示在大肠杆菌表面,展示HP的 菌株对Cd2+的结合能力增加1. 8倍,展示CP的菌株对Cd2+的结 合能力增加4倍. Samuelson等发现将His3 - Glu - His3和His6 与葡萄球菌蛋白（SpA）融合表达后能增强葡萄球菌(S. xy losus和S. carnosus)与Ni2+和Cd2+的结合能力. Xu等将长达 162个氨基酸的多聚组氨酸与OmpC融合,重组菌株吸附Cd2+ 的能力达32mol/g干菌.
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闵少颖 10708057
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引言 细胞表面展示系统的应用 几种不同的细胞表面展示系统 总结与前景展望
1 引言：利用重组DNA技术将不同蛋白展示在微生物细胞表
面作为一种新的生物除污方法已经出现，并且已经研究了细 菌和酵母在这方面的应用。细胞表面展示的特定蛋白使工程 微生物能够转运、生物聚集重金属或使重金属解毒，也能降 解外源性化学物质。本文介绍了微生物细胞表面展示技术在 通过金属结合蛋白增强重金属的生物聚集方面的应用，同时 也讨论了通过酶或微生物细胞表面的蛋白降解外源性化学物 质。
2.2 细胞表面展示增强外源性化学物质的生物降解作用
有机磷农药是目前使用最广泛的农药, 占农药总量的80% ,也 是毒害最大的农药之一,是一种神经毒素,可引起乙酰胆碱积累, 干扰肌肉反应. 从土壤微生物中分离的有机磷水解酶(OPH)能 有效地降解有机磷农药,降低其毒性,如对硫磷和甲基对硫磷经 OPH水解后毒性降120倍. 但是,用分离纯化的OPH来消除环 境中有机磷农药的毒性显然是不现实的,用整细胞进行污染物 脱毒费用也很高,而且有机磷难以透过细胞膜,效率很低. Richins等研究表明,表面展示OPH的工程菌降解对硫磷和对 氧磷的速度是胞内表达OPH菌株的7倍,而且比纯化的OPH更 稳定.
尽管酶水解能使对硫磷和甲基对硫磷等有机磷农药的毒性 下降120 倍,但其降解产物P - 硝基苯酚（PNP)仍被认为是 环境污染物. PNP不像有机磷农药,它在水中的溶解度很高. Spain和Gibson发现摩拉克氏菌能以PNP为唯一碳源,具有 降解PNP的能力. Shimazu 等通过INP将OPH展示在摩拉克 氏菌细胞表面,使单一工程菌具备同时降解有机磷农药和 PNP的能力,工程菌降解甲基对硫磷和对硫磷的速率分别为0. 6μmol h-1 mg-1和1. 5μmol h- 1 mg- 1 ,约比野生菌高10倍,工 程菌降解PNP的速率与野生菌相同.
植物螯合素( PCs)是植物和真菌中天然存在的金属结合肽, 含(Glu - Cys) 2 - 11 Gly结构,其金属结合能力比金属硫蛋白 强,Bae等将合成的PCs展示在摩氏杆菌细胞表面,重组菌与 汞的结合能力增强10倍.金属结合短肽、金属硫蛋白、 PCs结合金属离子的选择性较差,难以满足特殊要求. 其实 自然界存在许多有高度专一性的金属结合蛋白,许多细菌 可经诱导产生代谢和失活重金属毒性的运输蛋白和酶,例 如最近Bae等把金属调控蛋白(MerR)与冰晶蛋白（NP） 融合,使MerR展示在大肠杆菌细胞表面,这样得到的重组菌, 其Hg2+结合能力比野生型大肠杆菌JM109高出6倍. 而且, 对Hg2+有很强的专一性,对离子农度、pH值和金属螯合剂 不敏感,在超出Hg2+浓度100倍的Cd2+和Zn2+存在的情况下, 重组菌对Hg2+的吸附没有明显的减弱.
微生物表面展示技术是一种新的基因工程技术, 它使表达 的外源肽以融合蛋白形式展示在噬菌体或微生物细胞的表 面, 被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构 和生物活性。随着展示技术的发展, 人们可以更有效的认 识、改造和创建各种生物大分子。改造细胞表面结构, 比 改造细胞其他部位结构更容易实现, 因此也就更接近实际 应用。通过表面展示技术制备细胞表面吸附剂, 可在重金 属污染去除和毒性有机污染物的脱毒等环境保护领域以及 生物传感器和金属溶出等方面得到应用。微生物细胞表面 展示技术还可以应用于开发活的细菌疫苗、筛选抗体库、 生产生物细胞吸附剂以及制备整细胞生物催化剂。通过金 属高效结合肽的肽库筛选和微生物展示技术，将金属结合 肽直接展示在微生物的表面，用于处理环境中的重金属污 染，为环境中重金属污染的防治提供了一条新的途径。
3.1革兰氏阴性菌表面展示系统
革兰氏阴性菌展示系统的宿主细胞主要是大肠杆菌，载体 蛋白大部分都是利用外膜蛋白开发的。革兰氏阴性细菌展 示系统中主要应用N端融合，C端融合，插入融合三种融 合方法。
将酵母和哺乳动物的金属硫蛋白(metellothioneins,MTs)展 示在大肠杆菌细胞表面也已有不少成功的例子金属硫蛋白 富含半胱氨酸,能结合金属离子使其失活. Sousa等将酵母 和哺乳动物的金属硫蛋白与LamB融合,并表达展示在大肠 杆菌细胞表面,重组菌结合Cd2+的能力增强15～20倍,Valls 等和Kotrba等报道了类似的试验结果. 但是这类重组菌不 适用与原位土壤修复. 假单孢菌( Pseudom onas) 具有旺 盛生长能力、能在高度污染的环境中生长,具有生物修复 应用的潜力.Valls等将小鼠MTs与奈瑟氏球菌(N eisseria) IgA蛋白酶β- 结构域融合,并在恶臭假单孢杆菌( P. putita) 中表达,结果重组菌的重金属结合能力增强3倍.
2.1细胞表面展示增强重金属的生物富集
将富含组氨酸和半胱氨酸金属结合短肽通过与膜蛋白OmpC和 麦芽糖孔蛋白（ LamB ） 融合展示在细胞表面的研究已有许 多报道。Sousa等将六聚组氨酸通过LamB 展示在大肠杆菌表 面,重组菌对Cd2+的吸附和富集能力增加10倍,不过这种工程菌 对重金属的吸附缺乏专一性,除吸附Cd2+外,还可结合Zn2+ 、 Cu2+ 、Ni2+等. Kotrba等将Gly - His - His - Pro- His - Gly (用 HP表示)和Gly - Cys - Gly - Cys - Pro - Cys -Gly - Cys - Gly (用CP表示)分别与LamB融合展示在大肠杆菌表面,展示HP的 菌株对Cd2+的结合能力增加1. 8倍,展示CP的菌株对Cd2+的结 合能力增加4倍. Samuelson等发现将His3 - Glu - His3和His6 与葡萄球菌蛋白（SpA）融合表达后能增强葡萄球菌(S. xy losus和S. carnosus)与Ni2+和Cd2+的结合能力. Xu等将长达 162个氨基酸的多聚组氨酸与OmpC融合,重组菌株吸附Cd2+ 的能力达32mol/g干菌.