奶粉中低聚肽质量浓度测定方法
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２ 结果和讨论
２．１ 标准曲线的制作 用 质 量 浓 度 为１００ ｇ／ Ｌ的ＴＣＡ水 溶 液 配 制 质 量 浓
度为３ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽溶液， 取１０支比色 管 ， 依 次 加 入 ０．０， ０．２， ０．４， ０．６， ０．８， １．０， １．２， １．４， １．６ 和 １．８ ｍＬ上述溶液， 分别用质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的ＴＣＡ水 溶 液 补 足 至 ３．０ ｍＬ， 混 匀 后 按 １．２（ ２） 的 程 序 测 定 Ｏ Ｄ 值， 并以四肽的浓度为横坐标Ｘ， Ｏ Ｄ值为纵坐标Ｙ， 制 作标准曲线， 结果如图１所示。
图１ 双缩脲法测定肽质量浓度的标准曲线
２．２ 蛋白质的沉淀方法 经 过 酶 解 的 奶 粉 样 品 中 ， 蛋 白 质 、肽 类 化 合 物 和
游离氨基酸同时存在， 而双缩脲反应是建立在肽键颜 色反应的基础之上的［３］。因此， 蛋白质和肽类化合物都 参与了这个反应。为了准确测定肽类质量浓度， 需要 将样品中的大分子蛋白除去。
上清液中加入双缩脲试剂， 于５４０ ｎｍ下测定其ＯＤ值， 查标准曲线计算出样品中的肽质量浓度。
关键词： 牛乳； 奶粉； 肽； 双缩脲反应； 三氯乙酸
中图分类号： ＴＳ２５２．５１
文献标识码： Ａ
文章编号： １００１－ ２２３０（ ２００７） １０－ ００４７－ ０４
Ｄｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｍ ｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ
ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
中国乳品工业
奶粉中低聚肽质量浓度测定方法
任国谱１， 李忠海１， 彭美纯２， 鲁伟２
（ １．中南林业科技大学 食品科学与工程学院， 长沙 ４１０００４； ２．湖南亚华乳业有限公司技术中心， 长沙 ４１０１１６）
摘 要： 以四肽Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ为标样做标准曲线， 用质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的三氯乙酸沉淀奶粉中的大分子蛋白质， 经离心过滤后， 在
收稿日期： ２００７－ ０４－ １５ 基 金 项 目：国 家 十 一 五 科 技 支 撑 计 划 课 题（２００６ＢＡＤ０４Ａ１５）。 作者简介： 任国谱（ １９６４－ ） ， 男， 博士后， 研究方向为食品科学与工程。
１实验
１．１ 材料 Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ， 三 氯 乙 酸 （ 分 析 纯 ） ， Ｐｒｏｔａｍａｘ
Ｒ ＥＮ Ｇｕｏ－ ｐｕ１， ＬＩ Ｚｈｏｎｇ－ ｈａｉ１， ＰＥＮＧ Ｍｅｉ－ ｃｈｕｎ２， ＬＵ Ｗｅｉ２
（１．Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｕｎａｎ Ａｖａｄａｉｒｙ Ｃｏｒｐ． Ｌｔｄ．， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２００，Ｃｈｉｎａ）
酶。 主要仪器为紫外可见分光光度计（ ＵＶ－ ９１００型） 。
１．２ 方法 （ １） 粗蛋白质量浓度的测定采用微量凯氏定氮法［３］。 （ ２） 奶粉中肽质量浓度的标准测定程序： 准确称
取５．００ ｇ样 品 ， 用 蒸 馏 水 溶 解 并 定 容 至５０ ｍＬ， 制 得 样 品溶液。量取２．５ ｍＬ样品溶液， 加入２．５ ｍＬ质量浓度为 ２００ ｇ／ Ｌ 的 三 氯 乙 酸（ＴＣＡ）水 溶 液［１］， 于 漩 涡 混 合 仪 上 混合均匀， ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 然后将上清液全 部转移到５０ ｍＬ容 量 瓶 中 ， 并 用１０％的ＴＣＡ定 容 至 刻 度， 摇匀， 然后取６．０ ｍＬ上述溶液置另一 试 管 中 ， 加 入 双 缩 脲 试 剂４．０ ｍＬ， 于 漩 涡 混 合 仪 上 混 合 均 匀 ， 以 制 作 标 准 曲 线 的 零 号 管 作 空 白 对 照 ， 于５４０ ｎｍ 下 测 定 ＯＤ值， 对照标准曲线求得样品溶液中的肽质量浓度Ｃ （ｇ／ Ｌ）， 进而可求得样品中肽质量浓度。计算公式为： 肽 质量浓度＝ （ Ｃ×５０×５０／ ２．５×５．００） ×１００％， 其中Ｃ 为从标 准曲线中查到的肽质量浓度（ ｇ／ Ｌ） 。
取６支试管， 于 每 一 支 试 管 中 均 加 入４．０ ｍＬ酶 解 液， 按标准程序测定。将１～５号试管分别于６０， ７０， ８０， ９０ 和１００ ℃加 热 处 理１５ ｍｉｎ， ０号 试 管 于 室 温 下 放 置 ， 不 进行加热处理， 继而按标准程序测定ＯＤ值， 结果如图 ２所示。
图２ 反应温度对测定结果的影响
由图２可以看出， 反应温度对测定结果的影响不 明显， 故后续试验在常温下进行。 ２．３．３ 反应时间的影响
取６支试管， 分 别 加 入 酶 解 液４．０ ｍＬ， 按 标 准 程 序 测 定 ， 并 分 别 于 室 温 下 放 置 ０， ３０， ６０， ９０， １２０ 和 １５０ ｍｉｎ， 结果如图３所示。
图３ 反应时间对测定结果的影响
可见， 反应时间对测定结果几乎没有影响， ＴＣＡ
能迅速使蛋白质沉淀下来。
２．３．４ 回收率实验
配制４．０ ｍｇ／ ｍｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽水溶液 ，
按标准程序测定其中肽含量。实验重复６次， 结果见表
３， 与理论值吻合， 回收率为９９．５％±０．７５％。
（ ｍｇ·Ｌ－ １）
回收率 ／％
Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ
３．９８±０．０３
４．０
９９．５±０．７５
Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ＋ 全脂奶粉 ３．７５±０．０５
４．０
９３．８±１．３０
２．３．５ 精密度测试［９］ 配制质量浓度４．０ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽水
０引言
低聚肽不仅具有营养作用和生物活性， 而且还具 有快速吸收的特点， 因此， 低聚肽在奶粉中的应用前 景广阔， 为此建立准确快速的测定奶粉中肽含量的方 法， 符合行业的发展需求。
蛋 白 质 的 分 析 方 法 包 括 光 谱 法 、色 谱 法 和 生 物 化 学 法 等［１， ２］， 考 虑 到 快 速 性 和 方 便 性 ， 选 择 光 谱 法 进 行 研究。光谱法测定蛋白质含量的方法很多［１，３，４］， 如① 基 于碱性条件下， 含有肽键的化合物与Ｃｕ２＋形成紫红色 络合物的双缩脲法， ② 基于 碱 性 条 件 下 ， Ｆｏｌｉｎ酚 试 剂 易 被 蛋 白 质 中 的Ｔｙｒ或Ｔｒｙ还 原 成 蓝 色 化 合 物 的Ｆｏｌｉｎ 酚 试 剂 法 （ 即Ｌｏｗｒｙ法 ） ， ③ 基 于Ｔｙｒ或Ｔｒｙ在２８０ｎｍ 处 有吸收高峰的紫外吸收法， ④ 基于 肽 键 在２１５ ｎｍ和 ２２５ ｎｍ有特征吸收的紫外吸收法， ⑤ 基 于 蛋 白 质 与 染 料 结 合 后 发 生 颜 色 变 化 的 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 等 。其 中方法①和④是建立在以肽键为基础之上的， 并以双 缩脲法比较常用， 而且方法④的干扰因素较多。因此， 选择双缩脲法进行研究。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｌｋ ｗａｓ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ １０％ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ． Ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｌｔｒａ－ ｔｉｏｎ， ｂｉｕｒｅｔ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｅａｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ＯＤ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ５４０ｎｍ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｌｋ； ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ； ｐｅｐｔｉｄｅ； ｂｉｕｒｅｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
４８２００７ 年第 ３５ 卷第 １０ 期（ 总第 ２０３ 期）
上进行加热处理来沉淀蛋白质与单纯用三氯乙酸作
为沉淀剂的效果相差不大。
表１ 不同沉淀方法对测定结果（ＯＤ值）的影响
沉淀方法
测定结果
加热 三氯乙酸 磺基水杨酸
浓盐酸 乙酸铅
０．７８２ ０．２５９ ０．３０５ ０．２８２ ０．２５７
２．３ 影响ＴＣＡ沉淀作用的因素分析 ２．３．１ 加热对沉淀作用的影响
用 质 量 浓 度 为１００ ｇ／ Ｌ的 新 西 兰 全 脂 奶 粉 水 溶 液
配制４．０ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽溶液， 按标准程
序测定其中肽质量浓度。实验重复６次， 结果如表３所
示， 回收率为９３．８％±１．３％。
表３ 标准肽的回收率
测定值 ／ 理论值 ／
（ ｇ·Ｌ－ １）
溶液， 按相同程序进行６轮平行测定， 以检验测定程序 的精密度， 结果如表４所示。
表４ 精密度实验
测定轮数
ｘｉ１
１
３．９５
ｘｉ２ ４．００
表２ 加热对ＴＣＡ沉淀作用的影响
ｇ ／Ｌ
加Ｔ Ｃ Ａ后 沸 水 浴 加热１５ ｍｉｎ １．４７
加Ｔ Ｃ Ａ后 不 加 热 静置１５ ｍｉｎ １．５０
不 加Ｔ Ｃ Ａ沸 水 浴 加热１５ ｍｉｎ ４．２９
由表２可以看出， 使用ＴＣＡ的基础上， 再进行加热 处理对测定结果影响不大； 单纯的沸水浴中加热不能 有效的除去经酶水解处理的大分子蛋白质。因此， 后 续试验中不进行加热处理。 ２．３．２ 反应温度的影响
（ ３） 蛋白质沉淀方法： ①加热沉淀法。将样品在沸 水 浴 中 加 热 维 持１５ ｍｉｎ， 立 即 冷 却 至 室 温 ， 然 后 在
４７ Ｖｏｌ．３５， Ｎｏ．１０ ２００７（ｔｏｔａｌ ２０３）
测定方法 Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ
４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ下离心１５ ｍｉｎ， 取清液备用。②三氯乙酸 法。在样品中加入等体积质量浓度为２００ ｇ／ Ｌ的三氯乙 酸（ＴＣＡ）水溶液， 混合均匀后４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离 心１５ ｍｉｎ， 取 上 清 液 备 用 。③磺 基 水 杨 酸 法 。在 样 品 中 加 入 等 体 积 质 量 浓 度 为 １００ ｇ／ Ｌ的 磺 基 水 杨 酸 ， 混 合 均 匀 后 ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液备用。④浓盐酸法。 在 样 品 中 滴 加 浓 盐 酸 至 溶 液 ｐＨ 值 在 等 电 点 以 下 ， ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液备用。⑤乙酸铅沉淀 法。在样品中加入等体积质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的乙酸铅 水溶液， 混合均匀后４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液 备 用 。⑥加 热 并 加 三 氯 乙 酸 沉 淀 法 。在 样 品 中 加 入 等 体积质量浓度为２００ ｇ／ Ｌ的三 氯 乙 酸（ＴＣＡ）水 溶 液 ， 混 合均匀后并在沸水浴 中 加 热 维 持１５ ｍｉｎ， 然 后 立 即 冷 至室温， 于４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ下离心１５ ｍｉｎ， 取清液备用。
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固， 当蛋白 质处于等电点时， 加热凝固最完全、最迅速。向南山牌 中老年奶粉中加定量的全脂奶粉酶解液， 比较加ＴＣＡ 后沸水浴加热１５ ｍｉｎ， 加ＴＣＡ后不加热静置１５ ｍｉｎ和 不 加ＴＣＡ沸 水 浴 加 热１５ ｍｉｎ 三 种 情 况 下 测 得 的 肽 质 量浓度（ ｇ／ Ｌ） ， 结果如表２所示。
牛乳中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组 成［５￣９］， 酪蛋白受热沉淀； 但乳清蛋 白 中 ， 既 有 对 热 不 稳 定的乳白蛋白和乳球蛋白， 也有对热稳定的蛋白胨 等。因此， 单靠加热处理不能将蛋白质完全沉淀下来， 表１的实验结果也证明了这一点。虽然乙酸铅能有效 地沉淀蛋白质， 但是在食品行业中应该尽量避免使用 有 毒 试 剂 。浓 盐 酸 和 磺 基 水 杨 酸 都 能 作 为 蛋 白 质 沉 淀 剂， 但和三氯乙酸相比稍差。在使用三氯乙酸的基础
２．１ 标准曲线的制作 用 质 量 浓 度 为１００ ｇ／ Ｌ的ＴＣＡ水 溶 液 配 制 质 量 浓
度为３ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽溶液， 取１０支比色 管 ， 依 次 加 入 ０．０， ０．２， ０．４， ０．６， ０．８， １．０， １．２， １．４， １．６ 和 １．８ ｍＬ上述溶液， 分别用质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的ＴＣＡ水 溶 液 补 足 至 ３．０ ｍＬ， 混 匀 后 按 １．２（ ２） 的 程 序 测 定 Ｏ Ｄ 值， 并以四肽的浓度为横坐标Ｘ， Ｏ Ｄ值为纵坐标Ｙ， 制 作标准曲线， 结果如图１所示。
图１ 双缩脲法测定肽质量浓度的标准曲线
２．２ 蛋白质的沉淀方法 经 过 酶 解 的 奶 粉 样 品 中 ， 蛋 白 质 、肽 类 化 合 物 和
游离氨基酸同时存在， 而双缩脲反应是建立在肽键颜 色反应的基础之上的［３］。因此， 蛋白质和肽类化合物都 参与了这个反应。为了准确测定肽类质量浓度， 需要 将样品中的大分子蛋白除去。
上清液中加入双缩脲试剂， 于５４０ ｎｍ下测定其ＯＤ值， 查标准曲线计算出样品中的肽质量浓度。
关键词： 牛乳； 奶粉； 肽； 双缩脲反应； 三氯乙酸
中图分类号： ＴＳ２５２．５１
文献标识码： Ａ
文章编号： １００１－ ２２３０（ ２００７） １０－ ００４７－ ０４
Ｄｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｍ ｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ
ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
中国乳品工业
奶粉中低聚肽质量浓度测定方法
任国谱１， 李忠海１， 彭美纯２， 鲁伟２
（ １．中南林业科技大学 食品科学与工程学院， 长沙 ４１０００４； ２．湖南亚华乳业有限公司技术中心， 长沙 ４１０１１６）
摘 要： 以四肽Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ为标样做标准曲线， 用质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的三氯乙酸沉淀奶粉中的大分子蛋白质， 经离心过滤后， 在
收稿日期： ２００７－ ０４－ １５ 基 金 项 目：国 家 十 一 五 科 技 支 撑 计 划 课 题（２００６ＢＡＤ０４Ａ１５）。 作者简介： 任国谱（ １９６４－ ） ， 男， 博士后， 研究方向为食品科学与工程。
１实验
１．１ 材料 Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ， 三 氯 乙 酸 （ 分 析 纯 ） ， Ｐｒｏｔａｍａｘ
Ｒ ＥＮ Ｇｕｏ－ ｐｕ１， ＬＩ Ｚｈｏｎｇ－ ｈａｉ１， ＰＥＮＧ Ｍｅｉ－ ｃｈｕｎ２， ＬＵ Ｗｅｉ２
（１．Ｆｏｏｄ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｕｎａｎ Ａｖａｄａｉｒｙ Ｃｏｒｐ． Ｌｔｄ．， Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２００，Ｃｈｉｎａ）
酶。 主要仪器为紫外可见分光光度计（ ＵＶ－ ９１００型） 。
１．２ 方法 （ １） 粗蛋白质量浓度的测定采用微量凯氏定氮法［３］。 （ ２） 奶粉中肽质量浓度的标准测定程序： 准确称
取５．００ ｇ样 品 ， 用 蒸 馏 水 溶 解 并 定 容 至５０ ｍＬ， 制 得 样 品溶液。量取２．５ ｍＬ样品溶液， 加入２．５ ｍＬ质量浓度为 ２００ ｇ／ Ｌ 的 三 氯 乙 酸（ＴＣＡ）水 溶 液［１］， 于 漩 涡 混 合 仪 上 混合均匀， ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 然后将上清液全 部转移到５０ ｍＬ容 量 瓶 中 ， 并 用１０％的ＴＣＡ定 容 至 刻 度， 摇匀， 然后取６．０ ｍＬ上述溶液置另一 试 管 中 ， 加 入 双 缩 脲 试 剂４．０ ｍＬ， 于 漩 涡 混 合 仪 上 混 合 均 匀 ， 以 制 作 标 准 曲 线 的 零 号 管 作 空 白 对 照 ， 于５４０ ｎｍ 下 测 定 ＯＤ值， 对照标准曲线求得样品溶液中的肽质量浓度Ｃ （ｇ／ Ｌ）， 进而可求得样品中肽质量浓度。计算公式为： 肽 质量浓度＝ （ Ｃ×５０×５０／ ２．５×５．００） ×１００％， 其中Ｃ 为从标 准曲线中查到的肽质量浓度（ ｇ／ Ｌ） 。
取６支试管， 于 每 一 支 试 管 中 均 加 入４．０ ｍＬ酶 解 液， 按标准程序测定。将１～５号试管分别于６０， ７０， ８０， ９０ 和１００ ℃加 热 处 理１５ ｍｉｎ， ０号 试 管 于 室 温 下 放 置 ， 不 进行加热处理， 继而按标准程序测定ＯＤ值， 结果如图 ２所示。
图２ 反应温度对测定结果的影响
由图２可以看出， 反应温度对测定结果的影响不 明显， 故后续试验在常温下进行。 ２．３．３ 反应时间的影响
取６支试管， 分 别 加 入 酶 解 液４．０ ｍＬ， 按 标 准 程 序 测 定 ， 并 分 别 于 室 温 下 放 置 ０， ３０， ６０， ９０， １２０ 和 １５０ ｍｉｎ， 结果如图３所示。
图３ 反应时间对测定结果的影响
可见， 反应时间对测定结果几乎没有影响， ＴＣＡ
能迅速使蛋白质沉淀下来。
２．３．４ 回收率实验
配制４．０ ｍｇ／ ｍｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽水溶液 ，
按标准程序测定其中肽含量。实验重复６次， 结果见表
３， 与理论值吻合， 回收率为９９．５％±０．７５％。
（ ｍｇ·Ｌ－ １）
回收率 ／％
Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ
３．９８±０．０３
４．０
９９．５±０．７５
Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ＋ 全脂奶粉 ３．７５±０．０５
４．０
９３．８±１．３０
２．３．５ 精密度测试［９］ 配制质量浓度４．０ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽水
０引言
低聚肽不仅具有营养作用和生物活性， 而且还具 有快速吸收的特点， 因此， 低聚肽在奶粉中的应用前 景广阔， 为此建立准确快速的测定奶粉中肽含量的方 法， 符合行业的发展需求。
蛋 白 质 的 分 析 方 法 包 括 光 谱 法 、色 谱 法 和 生 物 化 学 法 等［１， ２］， 考 虑 到 快 速 性 和 方 便 性 ， 选 择 光 谱 法 进 行 研究。光谱法测定蛋白质含量的方法很多［１，３，４］， 如① 基 于碱性条件下， 含有肽键的化合物与Ｃｕ２＋形成紫红色 络合物的双缩脲法， ② 基于 碱 性 条 件 下 ， Ｆｏｌｉｎ酚 试 剂 易 被 蛋 白 质 中 的Ｔｙｒ或Ｔｒｙ还 原 成 蓝 色 化 合 物 的Ｆｏｌｉｎ 酚 试 剂 法 （ 即Ｌｏｗｒｙ法 ） ， ③ 基 于Ｔｙｒ或Ｔｒｙ在２８０ｎｍ 处 有吸收高峰的紫外吸收法， ④ 基于 肽 键 在２１５ ｎｍ和 ２２５ ｎｍ有特征吸收的紫外吸收法， ⑤ 基 于 蛋 白 质 与 染 料 结 合 后 发 生 颜 色 变 化 的 考 马 斯 亮 蓝 染 色 法 等 。其 中方法①和④是建立在以肽键为基础之上的， 并以双 缩脲法比较常用， 而且方法④的干扰因素较多。因此， 选择双缩脲法进行研究。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｌｋ ｗａｓ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ １０％ ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ． Ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｌｔｒａ－ ｔｉｏｎ， ｂｉｕｒｅｔ ｒｅａｇｅｎｔ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｅａｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ＯＤ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ｍｅｎｓｕｒａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ５４０ｎｍ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｔｒａｓｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｌｋ； ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ ； ｐｅｐｔｉｄｅ； ｂｉｕｒｅｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
４８２００７ 年第 ３５ 卷第 １０ 期（ 总第 ２０３ 期）
上进行加热处理来沉淀蛋白质与单纯用三氯乙酸作
为沉淀剂的效果相差不大。
表１ 不同沉淀方法对测定结果（ＯＤ值）的影响
沉淀方法
测定结果
加热 三氯乙酸 磺基水杨酸
浓盐酸 乙酸铅
０．７８２ ０．２５９ ０．３０５ ０．２８２ ０．２５７
２．３ 影响ＴＣＡ沉淀作用的因素分析 ２．３．１ 加热对沉淀作用的影响
用 质 量 浓 度 为１００ ｇ／ Ｌ的 新 西 兰 全 脂 奶 粉 水 溶 液
配制４．０ ｇ／ Ｌ的Ｇｌｙ－ Ｇｌｙ－ Ｔｙｒ－ Ａｒｇ四肽溶液， 按标准程
序测定其中肽质量浓度。实验重复６次， 结果如表３所
示， 回收率为９３．８％±１．３％。
表３ 标准肽的回收率
测定值 ／ 理论值 ／
（ ｇ·Ｌ－ １）
溶液， 按相同程序进行６轮平行测定， 以检验测定程序 的精密度， 结果如表４所示。
表４ 精密度实验
测定轮数
ｘｉ１
１
３．９５
ｘｉ２ ４．００
表２ 加热对ＴＣＡ沉淀作用的影响
ｇ ／Ｌ
加Ｔ Ｃ Ａ后 沸 水 浴 加热１５ ｍｉｎ １．４７
加Ｔ Ｃ Ａ后 不 加 热 静置１５ ｍｉｎ １．５０
不 加Ｔ Ｃ Ａ沸 水 浴 加热１５ ｍｉｎ ４．２９
由表２可以看出， 使用ＴＣＡ的基础上， 再进行加热 处理对测定结果影响不大； 单纯的沸水浴中加热不能 有效的除去经酶水解处理的大分子蛋白质。因此， 后 续试验中不进行加热处理。 ２．３．２ 反应温度的影响
（ ３） 蛋白质沉淀方法： ①加热沉淀法。将样品在沸 水 浴 中 加 热 维 持１５ ｍｉｎ， 立 即 冷 却 至 室 温 ， 然 后 在
４７ Ｖｏｌ．３５， Ｎｏ．１０ ２００７（ｔｏｔａｌ ２０３）
测定方法 Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ
４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ下离心１５ ｍｉｎ， 取清液备用。②三氯乙酸 法。在样品中加入等体积质量浓度为２００ ｇ／ Ｌ的三氯乙 酸（ＴＣＡ）水溶液， 混合均匀后４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离 心１５ ｍｉｎ， 取 上 清 液 备 用 。③磺 基 水 杨 酸 法 。在 样 品 中 加 入 等 体 积 质 量 浓 度 为 １００ ｇ／ Ｌ的 磺 基 水 杨 酸 ， 混 合 均 匀 后 ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液备用。④浓盐酸法。 在 样 品 中 滴 加 浓 盐 酸 至 溶 液 ｐＨ 值 在 等 电 点 以 下 ， ４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液备用。⑤乙酸铅沉淀 法。在样品中加入等体积质量浓度为１００ ｇ／ Ｌ的乙酸铅 水溶液， 混合均匀后４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ， 取上清液 备 用 。⑥加 热 并 加 三 氯 乙 酸 沉 淀 法 。在 样 品 中 加 入 等 体积质量浓度为２００ ｇ／ Ｌ的三 氯 乙 酸（ＴＣＡ）水 溶 液 ， 混 合均匀后并在沸水浴 中 加 热 维 持１５ ｍｉｎ， 然 后 立 即 冷 至室温， 于４ ０００ ｒ／ ｍｉｎ下离心１５ ｍｉｎ， 取清液备用。
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固， 当蛋白 质处于等电点时， 加热凝固最完全、最迅速。向南山牌 中老年奶粉中加定量的全脂奶粉酶解液， 比较加ＴＣＡ 后沸水浴加热１５ ｍｉｎ， 加ＴＣＡ后不加热静置１５ ｍｉｎ和 不 加ＴＣＡ沸 水 浴 加 热１５ ｍｉｎ 三 种 情 况 下 测 得 的 肽 质 量浓度（ ｇ／ Ｌ） ， 结果如表２所示。
牛乳中的蛋白质主要由酪蛋白和乳清蛋白组 成［５￣９］， 酪蛋白受热沉淀； 但乳清蛋 白 中 ， 既 有 对 热 不 稳 定的乳白蛋白和乳球蛋白， 也有对热稳定的蛋白胨 等。因此， 单靠加热处理不能将蛋白质完全沉淀下来， 表１的实验结果也证明了这一点。虽然乙酸铅能有效 地沉淀蛋白质， 但是在食品行业中应该尽量避免使用 有 毒 试 剂 。浓 盐 酸 和 磺 基 水 杨 酸 都 能 作 为 蛋 白 质 沉 淀 剂， 但和三氯乙酸相比稍差。在使用三氯乙酸的基础