神经元的再生

操纵神经元生长锥来促进轴突越过抑制剂分子再生由于在受到伤害后体内成熟的神经元的轴突生长能力的降低和体外环境中不利的抑制因子的影响，中枢神经系统中的神经元不能使轴突再生。最近的研究显示，标记一组特殊的体外抑制因子来触发长距离的神经轴突的再生是不可行的。为了代替对生长起反作用这个缺陷，解决一个普通的目标能够调节轴突的生长抑制提供一个不同寻常的策略去促进轴突的再生。神经元生长椎可以使轴突伸展，是最多的终端聚集靶点，即使不是全部，在中枢神经系统中也会妨碍轴突生长。在这项研究中，我们准备通过直接调节圆锥细胞的生长来促进轴突的再生。在这里我们用药理学的抑制或肌球蛋白的基因沉默来显著的促进轴突的再生而不是任意和非许可的酶作用物，就像主要的中枢神经系统抑制剂如硫酸软骨素蛋白聚糖和髓鞘相关抑制剂。我们发现肌球蛋白Ⅱ抑制剂能使肌动蛋白和微管在生长锥里重组，从而使微管改编允许快速轴突伸展超过抑制剂培养基。除了增进轴突的伸展之外，我们得到肌球蛋白Ⅱ在轴突里活性的局部封闭可以引发轴突越过自由抑制剂的边界而生长。同时，我们的研究提示肌球蛋白Ⅱ和生长锥细胞支架的成分是促进轴突再生的有效靶点。

1.微管伸展到生长锥的边缘是轴突生长的基本过程，因为当连接到一个退化的

肌动纤维时微管会自动远离重要边缘，我们为了测试通过抑制NMⅡ的活性来使流动的肌动蛋白获得能量是否能够提高轴突的生长能力而做了以下实验。

Fig.1封锁肌球蛋白的活性促进轴突的再生

胎儿的DRG神经元培养在任意培养基（单独的多聚赖氨酸或多聚赖氨酸加层粘连蛋白）或抑制剂培养基（CSPGs或聚集蛋白聚糖）有或没有blebbistatin或Y27632作为标记。神经元被固定（在多聚赖氨酸里20—22小时后固定，在其他所有的培养基里12—14小时后固定）和用TuJ1抗体做免疫组化。测量轴突的长度（A和B）与典型的图片（C，TuJ1抗体做免疫组化的反向图片）。（D—F）出生后的小脑小颗粒神经元被培养在多聚赖氨酸，聚集蛋白聚糖或髓鞘提取物在有或没有blebbistatin作为标记。测量轴突的长度（D和E）与典型的图片（F）。

当NMⅡ的活性被抑制后，我们发现胎儿的背部根神经节在任意培养基中轴突生长能力随着剂量依赖方法提高了。令我们惊喜的是，NMⅡ的活性被封锁后不能使神经元完全克服由CSPGs引起的轴突生长抑制作用。我们也观察到CSPGs和聚集蛋白聚糖的抑制效果，通过Y27632，有些CSPGs的作用有所缓解。

2.接下来我们检验了一下如果NMⅡ的抑制能够提高成人神经元的轴突生长能

力，那哪一些与轴突的再生更相关呢？我们做了以下实验。

Fig.2. 肌球蛋白Ⅱ的抑制引起来自成人的DRG神经元的强大轴突在聚集蛋白聚糖里的伸展。（A和B）来自条件损伤小鼠的成人DRG神经元培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基或聚集蛋白聚糖里有或没有blebbistatin 或Y27632，作为标记。测量轴突的长度（A）和典型的图片（B）。（C—E）成人的DRG神经元用venus和siRNAs转染来对抗NMⅡA(siNMⅡA)和ⅡB(siNMⅡB)做标记。在转染

4天后，收集神经元做蛋白质印记（C），或在多聚赖氨酸加层粘连蛋白电镀或聚集蛋白聚糖允许轴突再生长（D和E）。典型的免疫印记（C）和用venus和siRNAs 转染神经元的电镀图（E中的箭头）显示的。测量的轴突的长度在D中。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; n.s., not signi fi cant。

这些结果暗示，在任意培养基中封闭NMⅡA的活性可以对由blebbistatin 引起的轴突生长促进作用有很大的关联，然而在抑制剂培养基中，轴突的生长促进作用是由NMⅡA和NMⅡB共同抑制的结果。然而，在这个研究中被用到的电镀过程与神经元中NMⅡ抑制不断生长的轴突或有长轴突的神经元的表达作用不同，这是因为NMⅡ在生长锥中的转向可能是不同的。

3.为了了解哪一个NMⅡ调控轴突的生长的细胞机制，我们首先检验了一下NM

Ⅱ亚型在生长锥里的局部化情况。

Fig.3. NMⅡA和NMⅡB在生长锥中的定位。（A和B）培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基中的胎儿的DRG神经元用鬼笔环肽和NMⅡA或NMⅡB抗体染色。指出肌动蛋白的弧形结构和NMⅡ亚型的局部翻译被blebbistatin的应用所减少。

结果显示在生长锥细胞中NMⅡA的免疫染色结果和NMⅡB相比效果不显著。在过渡区域NMⅡA的局部与NMⅡB很相似，但是在神经末梢区域NMⅡA与肌动蛋白纤维也结合。NMⅡ亚型在过渡结构域的特殊的局部与它们在生长锥中调节退化的肌动纤维的作用是一致的，并且NMⅡ局部的明显减少是对blebbistatin的效果提供一个了解blebbistatin结构的基础。

4.为了更进一步的研究哪一个NMⅡ抑制导致了轴突生长增强的分子机制，我

们检验了生长锥的细胞骨架结构和它们在应答blebbistatin时的结构改编情况，做了以下实验。

Fig.4. NMⅡ抑制引起生长锥细胞支架结构的改编。（A—E）培养在多聚赖氨酸加层粘连蛋白培养基中的胎儿的DRG神经元（A和C）或聚集蛋白聚糖（B和D）有（C和D）或没有（A和B）blebbistatin用鬼笔环肽和tublin抗体染色。每一张图片暴露的时间随着增加肌动蛋白的能见度而调整。典型的图片（A—D）和

生长锥结构的量化（E）。（F和G）成人的DRG生长锥典型的图片。成人的DRG 神经元培养在多聚赖氨酸加多聚赖氨酸（F）或聚集蛋白聚糖（G）有或没有blebbistatin作为标记，并且用鬼笔环肽和tublin抗体染色。

NMⅡ的抑制把微管从扁长型的结构释放出来并且允许微管朝着主要边界伸展，结果导致生长锥的细胞支架结构与在任意培养基中类似。

5为了检验通过NMⅡ抑制如果引起细胞骨架的改编从而影响轴突的生长速率，我们通过时间间隔显微镜来分析轴突的生长。

Fig.5.轴突的伸展促进CSPGs产生通过NMⅡ抑制要求肌动蛋白和运输动力学。成人的DRG神经元来自于条件损伤小鼠在CSPGs里电镀并且第一次用blebbistatin或DMSO处理作为一个对照组。处理了13个小时后，细胞松弛素D 或噻氨酯哒唑加入blebbistatin包含培养并且再另外培养8个小时，显示细胞松弛素D或噻氨酯哒唑完全阻止了当加入blebbistatin后积极伸展的轴突的促进效果。然而那些只用blebbistatin处理的神经元在继续伸展。

结果支持blebbistatin促进轴突生长，CSPGs直接影响生长锥细胞支架结构。

6.为了成功的再生，轴突的装配必须越过有抑制剂的培养基，但是在进入抑制剂区域损害轴突之前，它们遭遇了任意抑制剂环境的边界。扩展轴突穿过相同抑制