浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究
酿酒
HQUOR MAKING
V01．30．No．2
Mar．，2OO3
文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4
浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究
王耀，范文来，徐岩2，刁亚琴，陆红珍
(1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036) 摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传
统测定方法(需反应100h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应
条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，35 的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加
入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。
关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法
中图分类号：TS262．31；TQ925 文献标识码：A‘
0 前言
酯酶(Eaemse E．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水
解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸
酯Ll J。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因
此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7 J。酵母、霉
菌、细菌中均含有酯酶[ ，6．。目前已经发现，红曲霉、根霉中
许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5' 。
酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一
类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerd acy／hydro／aseo脂肪酶的正
式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘
油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按Novo Nordisk公司的定义，
脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶，
而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。
对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J，
但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20
世纪90年代[ 一·M一刮。
传统的酯化力测定方法【6J，是利用皂化反应和反滴定法
来测定。此法测定时间长，操作复杂。本文研究了利用有机
相代替水相的酯化酶活力的测定。
0．1 传统酯化力的测定【6J 6
先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯
皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反
应式为：
RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH
2NaOH+ Sq—一Na2S04+2H20
0，2 优化后酯化力测定方法的原理
近年来，酶在有机相中的生物催化作用因其潜在的工业
用途而日益受到人们的重视[117,18】。与水相催化相比，有机
介质可以增加酯酶的热稳定性，增加非极性底物的溶解度，
减少反应副产物，还可能影响酶的底物特异性及酶反应的平
收稿日期：2o03—01—16
衡方向和反应速度。有机溶剂相中酯化反应平衡点与速率
同溶剂中水含量密切相关，有机溶剂作为反应介质时，在一
个狭窄的初始含水量范围内，酶有较高的催化酯化活力。当
初始加水量较低时，酶分子由于不能获得形成活力构象所必
需的水，表现出较低的催化反应活力；当体系中水初始含量
高时，从物理状态来看，在反应的初始阶段酶粉即发生粘结，
产生吸附现象，无法均匀分散，故反应速率也降低。对本研
究而言，所加入的酶不是纯酯化酶，而是加入一定量的带水
分的大曲，大曲含水量在12％左右，此时反应体系中的含水
百分比约为6％左右，这虽然高于一般反应介质的最佳含水
量【181，但仍处于微水范围。而且，反应所利用的酯化酶是从
大曲颗粒里浸出来的，酶量很少，加上曲粉的间隔作用，这样
的含水量是不会发生酶粘结现象的，因此采用无水有机溶剂
与试剂进行酯化力的测定方法是可行的。
现以正庚烷为有机溶剂来代替水相进行酯化力测定方
法的优化，以期在尽可能短的时间内鉴别出大曲酯化能力的
高低。由于大曲的酯化反应是可逆反应，因此不仅要优化条
件以确保酯化能力最强，同时还要确保在此条件下分解能力
最差，只有酯剩余量多的条件才是最适条件。
1 试验材料
1．1 大曲
1．1．1 粉碎
用微型植物粉碎机粉碎。筛孔~'lmm。
1．1．2 分样
采用四分法。通常样品需要量500 引。
1．1，3 大曲样品分类方法
见参考文献[23】。
1．2 试剂
1．2．1 正庚烷，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入3og无水硫酸钠。
1．2，2 己酸，AR级，每瓶试剂(500ⅡlL)加入30g无水硫酸钠。1．2．3 无水乙醇，AR级，每瓶试剂( )加入30g无水硫
酸钠。
1．2．4 pH4，6醋酸一醋酸钠缓冲液，配制方法见参考文
献【6J。
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第2期王耀，等：浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究·l9 ·
1．2．5 100m~100mL己酸乙酯的20％(v／v)乙醇溶液，配制
方法见参考文献。
1．3 仪器
恒温培养箱：上海恒三仪器厂。
2 测定方法
2．1 传统酯化力的测定方法具体见文献【6J。
2．2 优化后酯化力测定方法
影响己酸乙酯合成反应的因素有很多，做单因素分析实
验，对加入底物酸(己酸)与乙醇的浓度、加曲量和反应温度
等进行优化。每间隔一段反应时间，取出上清液0．2mL于
50mL三角瓶中，加入5mL水，1滴酚酞，用O．025MNaOH滴定至酚酞终点，记下消耗的毫升数。计算公式为：
降酸％=(Vl—V o)×100％vo
式中：v0一反应前消耗NaOH的体积(mL)
vl——反应一段时间后消耗NaOH的体积(mL)
3 结果与讨论
3．1 酯化力
3．1．1 传统方法测定酯化力
传统方法采用100mL 1％的己酸、乙醇溶液，加相当于5g
干曲的曲量，在30—32℃酯化100h，用NaOH皂化己酸乙酯
来求得己酸乙酯量。下面对1 、2 曲及陈曲的酯化力进行
测量，以便进行优化的研究(表2)。
表2 传统方法测定酯化力(三次平均)
从表2可以看出，大曲的质量越好，酯化力越高；贮存时
间短的曲(三个月以上)，酯化力越大，但陈曲的酯化力不高。
因此，仅从酯化力考虑，大曲的贮存时间也不可过长，否则，
酯化力会大幅度下降。
3．1．2 优化方法的建立
影响酶在有机溶剂中催化合成己酸乙酯反应的因素
有．2 】：第一，底物浓度比(酸、醇浓度比)。第二，加酶量。
加酶量有一个临界值，当加酶量小于临界值时，会影响反应
平衡转化率；当加酶量超过临界值后，平衡转化率不再发生
变化，而反应速度随着酶量的增加而加快。第三，底物的浓
度、尤其是有着较强极性的己酸浓度，直接关系着酶的催化
活性和稳定性。第四，反应温度。它既关系着酶的活性，也
关系着反应速度。第五，有机相中，酶的催化活性与反应系
统的含水量密切相关，只有最适含水量时，酶最稳定，且表现
出最大活力。
3．1．2．1 底物酸与醇的比例对酯化反应的影响
理论上，己酸与乙醇反应的摩尔比为1：1，为使反应向己
酸乙酯方向顺利进行，醇应略过量。设定乙醇的三个梯度。
定量：正庚烷30mL，己酸0．15tool，绝干曲量5g，温度
30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。
变量(摩尔比)：己酸：乙醇=1：1．15(样品一) 己酸：
乙醇=1：1．25(样品二) 己酸：乙醇=1：1．35(样品三)
螽
逝
0 50 100 150h
+ 样一
+ 样二
+ 样三
图1 底物酸与醇比例对鸶化的影响
由图1知：样品二的降酸幅度大于样品一和样品三，说
明样品二比样品一、样品三早达到平衡点，所以取底物酸与
醇比例为1：1．25。
3．1．2．2 加曲量对酯反应的影响
定量：正庚烷30mL，己酸-乙醇=1：1．25，己酸浓度
0．15mol，温度30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。
变量：加曲量分别为5g、10g、15g(若加入20g大曲则会没
有溶剂剩余)。
由图2可知：最佳加曲量为15g。
蕊
世
反应时间(x10 )
图2 加曲量对酯化的影响
3．1．2．3 底物酸浓度对酯化反应的影响
资料表明【培J，当基质中己酸含量在50×10一以下时，己
酸乙酯按比例增加，在(50—70)×10I6之间，己酸乙酯虽有增加，但升幅较大。
3．1．2．3．1 设定己酸浓度梯度为0．1—1．0mol，确定最佳底物酸浓度。
定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1：1．25，干曲量15g，温
度30℃，在100mL磨口三角瓶中反应。
变量：己酸浓度分别为0．1n 、0．2mol、0．4mol、0．6mol、0．8mol、1．0mol。
图3说明底物酸浓度太高时，便抑制反应向己酸乙酯方
向进行，0．1mol浓度时降酸最快。
3．1．2．3．2 设定己酸浓度在0．1—0．2tool之间。
定量：同上。
变量：己酸浓度分别为0．1tool、0．125mol、0．15mol、0．175mol，作图4。
∞牾柏∞衢∞坫加5 O
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·20 ·酿酒
60
50
40
鑫。。
澄20
10
螽
澄
0 50 100h
己酸降酸曲线
圈3 己酸浓度对酯化的影响
—●一0．1M
．- II-0．
+ 0．4M
* 0．6M
0．8M
+ 1．oM
圈4 底物酸浓度对酯化的影响
由图4可以看出0．1mol与0．2mol间的降酸曲线斜率差
距不大。0．15tool的降酸稍微快一点，所以优化后所得的己
酸浓度为0．15tool。
3．1．2．4 温度对酯化反应的影响
资料表明，在低温25—30℃时，生成总酯量高。随着温
度上升，总酯量明显下降。酿造过程中，曲霉与酵母对己酸
都有不同程度酯化能力。当酵母与曲霉两者共同作用时，则
己酸乙酯量大增。产酯酵母主要是球拟酵母，35℃时产酯量
最高，曲霉作用温度也在35℃左右。于是作三个温度梯度，
以期找到最佳温度。
定量：正庚烷30mL，己酸：乙醇=1-1．25，己酸浓度
0．15M，干曲量15g，在100mL磨121三角瓶中反应。
变量：酯化反应温度为25℃、30℃、35℃。如图5。
0 50 100h
圈5 温度对酯化反应的影响
+ 25℃
+ 30℃
+ 35℃
由图5可以看出，35℃时反应最快，因此选用的酯化反
应的温度为35℃。
3．1．2．5 酯化反应最佳条件
综上所述，优化后最终的酯化反应条件为：在30mL正庚
烷有机反应介质中，加入底物酸与乙醇，底物酸的浓度为0．15mol，己酸与乙醇的浓度比为l：1．25，加入大曲15g，在100mL的磨口三角瓶中，35℃的条件下反应。
3．1．3 优化后的方法与传统方法对比
优化以后的测定与传统方法相比具有很大优点，主要体
现在以下几个方面(见表3)
表3 优化前后方法的对比
优化前的方法优化后的方法
反应介质
测酯方法
方法简易度
反应时间
测定结果
水相有机溶剂相
用碱皂化。直接测定测定降酸量，间接测定
经蒸馏、皂化、滴定，复杂只用滴定，简单
100h 24h
两者相同
从表3可以看出优化后测定方法的优势所在。两种方
法时间上的明显差距，使得优化后的方法更加适用于实际生
产中的测定。
4 结论
4．1 传统酯化力测定方法操作复杂，耗时长。采用在有机
相中反应的方法来测定大曲的酯化力，则相对比较简单，且
检测时间可以缩短至24h，有利于大生产中快速检测。
4．2 优化最佳测定条件为：在30mL正庚烷有机反应介质
中，加入己酸与乙醇，己酸的浓度为0．15tool，己酸与乙醇的
浓度比为1：1．25，加入大曲粉15g，在100mL的磨口三角瓶
中，35℃的条件下反应24h，测定降酸量。
【参考文献】
[1]无锡轻工业学院，等．生物化学(工业发酵专业用)[M]．轻工业
出版社。1980，11．‘
[2]Desnuelle P，Adv．B1 [J]．，1961，223：129—159．
[3]V e~-erR．。Meth．E~ymolEJ]．，1980，64：340—392．
Ea]B．施特尔马赫．酶的测定方法[M]．中国轻工业部出版社。1992．
[5]范文来，徐岩．大曲酶系研究的回顾与展望[J]．酿酒，2000，(3)．
[6]沈怡方．白酒生产技术全书[M]．中国轻工业出版社，1998，10．
[7]胡晓，等，脂酶的酯化反应特性及其在酿酒工业中的应用[J]．
酿酒科技，1997，(5)：13—16．
[8]吴衍庸，泸型红曲霉增香在浓香型酒上应用研究进展[J]．酿酒科
技。1999，(1)：18—20．
[9]谢红想，有机相中芳香酯合成用脂肪酶产生菌的筛选及其应用
[C]．硕士学位论文．
[10]徐岩，无锡轻工大学博士论文Ec]．1997．
[11]T．Nielsen，Industrial Application Possibilities for Lipase[C]．Lecture at tl 39 DEF—Meetinginn~ el-，27 Sep 1983．
[12]周恒刚，等，回顾三十年来白酒生产技术的成就[J]．黑龙江发
酵，1981，(4)：1—8．
[13]李大和，建国五十年来白酒生产技术的伟大成就[J]．酿酒，
1999，(1)、1999，(2)．
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第3O卷第2期
2 0 0 3年3月
酿酒
LIQUORMAKING
V o1．30，No．2
Mar．，20O3
文章编号：1002—8110{2003}02—0021—03
防腐剂一苯甲酸的微生物降解研究
苗艳芳，王忠彦，胡承，盂勇
(四川大学生命科学院，四川成都610064)
摘要：通过驯化培养，从废水中分离出一株能高效降解苯甲酸的BJs3菌株，经鉴定，该茵为斑生假单孢茵
(Pseudomonas碱黜如)，该茵还可以利用苯乙酸、对羟基苯甲酸为唯一的碳源和能源生长。研究了温度、、
c 、、氮源，碳源以及微量元素对茵株生长的影响。在优化培养条件下，BJS3菌株在24h 内对苯甲
酸的降解率达99．93％。
关键词：苯甲酸；斑生假单孢茵；生物降解
中图分类号：Q935；．3 文献标识码：A
苯甲酸又名安息香酸(c6H5COOH)，对多种微生物细胞
的呼吸酶系的活性有抑制作用，对于阻碍乙酰辅酶A的结合
反应具有较强的作用，并对微生物的细胞膜有阻碍作用。因
此它既能抑制广泛微生物的繁殖，又具有良好的杀菌作用，
其防腐效果较好，因此广泛地被作为防腐剂添加于饮料、汽
酒及日常调味品中。而且苯甲酸也是一类常见的环境污染
物，常存在于化工、食品和医药工业的废水中。关于这类化
收稿日期：2002—12—27
作者简介：苗艳芳(1977一)，女，河北人，在读硕士研究生，主
要从事微生物发酵与遗传工程方面的研究。
合物的生物降解机理和应用研究受到广泛重视[1,2J。由于这
类化合物具有很强的抑制作用，所以使含有这类化合物的工
业废水的处理具有较大的难度。因此，对于苯甲酸类化合物
微生物降解的生物化学和遗传学的研究，有利于阐明芳香化
合物的生物降解机制，从而分离和培育出降解谱广和降解性
能高的菌株，用于环境污染物的生物治理。本文从汽酒厂废
水中分离出一株能高效降解苯甲酸的细菌，并对其最适生长
和降解条件、底物特异性等进行了研究。
1 材料和方法
1．1 茵种来源
从成都附近汽酒厂的废水中驯化、筛选获得。
[14]周恒刚，漫谈己酸乙酯的酯化[J]．酿酒科技，1998，(3)：18—21．
【15]傅金泉，黄建平，我国酿酒微生物研究与应用技术的发展(上)[J]
．酿酒科技，1996，(4)：21—26．
【16]姚万春，等，曲药酯化酶活力测定方法的初步研究【J]．酿酒科
技，1996。(5)：61．
【17]徐岩，章克昌，等，固定化脂肪酶有机相中催化己酸乙酯反应动
力学研究[J]．生物工程学报，1999，(4)：533—536．
【18]徐岩，章克昌，等，微生物脂肪酶非水相合成短链芳香酯的研
究[J]．生物工程学报，1998，(2)．
[19]邓勃．分析测试数据的统计处理方法[]．清华大学出版社，
1995．
[20]费荣昌，费定晖．概率统计[M]．山东科学技术出版社，1985．
【2t]岩井，美枝子．酵素脂肪酶的基础研究和应用【J]．油脂，1998，41
(3)：82．
【22]杨慎，等．低水有机介质中酶的催化【]．生物化学与生物物理
进展，1994，21(2)．
【23]范文来，徐岩，等，浓香型大曲水解酶系及测定方法的研究【J]．
酿酒，2002，(5)：25—31
Study on the determination method about the esterifying enzymes from
DaQu of Chinese Strong Flavour Liquor M她
WUANG Yao ，FAN Wen—Lai ，XU Yi ，DIAO Y a一，叫Hong —zhen
(1．Jian$su Y埘Ie Co．Ltd．，SIlqian Jian$su 223725，(3fina，2．School 0f Biotechnolo~y，Southern Y angtze University，Wufi 214036，chi~)
AlkqlXACTI~ checkingmethod aboutthe esterifying enzymesfrom DaQu was completely studiedinthis paper．ReactioniIlthe oxalic phase
could rapidly analyses the e啦e enzyIne$power，acIal 【lg to the demand of industrialized product，o0mp with traditional method．The
best conditiom 88 followed：35~C，0．15M n—capmic acid，1：1．25 of n-caproic acid and e 吐alcohol，equal 15g dry DaQu was joln~d into
30mLn—h~tane，the esteritlcatlon 0f diferent q~Uty D o,~an be di shed in 24 hour，which was much less than the conversation
raeamlre8’100 hour．
KEY W ORDS：Chinese Strong FlavonrLiquor，，伪嘧eazymes，esteIi |-g，detem~nationmethod 维普资讯https://www.360docs.net/doc/f818553943.html,
SOD酶活性测定方法
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
第六章 酶的非水相催化
第六章酶的非水相催化 教学目的：使学生了解并掌握酶非水相催化的概念及意义，掌握酶非水相催化技术。 教学重点、难点：酶非水相催化机理。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节酶非水相催化研究概况 一、概念及分类 （一）、概念： 酶在非水介质中进行的催化作用。 1984年，美国A.M.Klibanov在《科学》上发表一篇关于酶在有机介质中催化条件和特点的综述，并成功酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。指出，酶可在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化，对酶只能在水溶液中起作用的传统酶学思想提出了挑战。 （二）、分类 1、有机介质中的酶催化 指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化作用 适用范围：底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。主要研究对象 2、气相介质中的酶催化 指酶在气相介质中进行的酶催化反应。 适用范围：底物是气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。研究较少。 3、超临界流体介质中的酶催化 指酶在超临界流体中进行的催化反应。 …绿色化学? ——无毒、无害要求，代替有机溶剂 4、离子液介质中酶的催化 离子液：有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好；酶反应具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等优点。 二、有机相酶反应的优点 ⒈有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续 生物转化。） ⒉可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。 ⒊能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中） ⒋可改变反应平衡移动方向（使许多热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酶 合成，酯交换等）主要朝着合成而不是水解的方向进行。 ⒌可控制底物专一性（不同底物反应所选最适溶剂不一定相同）。 ⒍可防止由水引起的副反应。 ⒎可扩大反应pH 值的适应性。 ⒏酶易于实现固定化。 ⒐酶和产物易于回收。（酶不溶于有机溶剂，有利于产物分离和酶的回收利用，且从低 沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。） ⒑可避免微生物污染。 仿水溶剂体系 原理: 可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇，丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的辅助溶剂水，从而影响酶的活性和立体选择性。 仿水溶剂体系 极性添加剂对体系的影响
酶催化反应研究进展
1 绪论 酶作为生物催化剂，具有专一性、高效性、反应条件温和等优点，是一种具有特殊三维空间构象的蛋白质，它们在体内几乎参与了所有的转变过程, 催化生物分子的转化。同时, 它们也催化许多体内存在的物质发生变化, 使人体正常的新陈代谢得以运行。因此受到人们的普遍关注。近年来, 特别是随着生化技术的进展, 酶催化反应越来越多地被有机化学家作为一种手段应用于有机合成, 特别是催化不对称合成反应。光学活性化合物或天然产物的合成, 已应用于医药、农药、食品添加剂、香料、日用化学品等精细有机合成领域。酶催化不会污染环境, 经济可行, 符合绿色化学的方向, 具有广阔的前景。 2 酶催化与有机合成反应 对于酶催化反应在有机合成中的应用, 有机合成工作者做了大量工作。随着科技进步的日新月异, 酶催化反应越来越多地被有机化学家作为一种手段用于 有机合成特别是不对称合成反应, 进行光学活性化合物或天然产物的合成时, 能为天然或非天然产物的合成提供丰富的手性源, 其应用前景将是难以估量的。2.1 不同反应体系中的酶促反应 2.1.1 有机介质中的酶促反应 酶在有机介质中不但能保持其活性，还表现出一些特殊性质，并具有如下优越性：有利于疏水性底物的反应；产物和酶易于回收；可改变反应平衡移动的方向；可控制底物专一性；可防止由水引起的副反应；可扩大反应pH值的适应性；可提高酶稳定性；可避免微生物污染等。在保证必需含水量；选择合适的酶及酶形式；选择合适的溶剂；选择最佳pH值；选择合适的反应体系的条件下，则在有机介质中酶可显示很高的催化活性。目前在有机介质中已成功用酶进行了氧化、、脱氢、脱氨、还原、羟基化、甲基化、环氧化、酯化、酰胺化、磷酸化、开环反应、异构化、侧链切除、缩合及卤化等反应。 过去人们认为酶在有机介质不稳定，但研究发现大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。一是表现在热稳定性提高。在有机介质中，在不同温度下保温脉酶，发现热处理导致酶活性增加，而且酶在温度远超过其在水溶液中最适
溶菌酶提取
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
有机溶剂中酶催化活性研究进展
有机溶剂中酶催化活性研究进展 摘要：酶在有机溶剂中催化作用的研究日益受到重视，其应用范围也越来越广。本文就有机介质中酶催化的影响因素进行了探讨，并归纳出提高酶活性的一系列方法，最后简要介绍了有机溶剂中酶的应用。 关键词：有机溶剂；酶催化 一直以来，人们认为“生物催化必须在水溶液中进行”、“有机溶剂是酶的变性剂、失活剂”，而1984年，Klibanov[1]提出:“只要条件合适，酶在非生物体系的有机溶剂中同样具有催化功能”的理论使酶学概念发生了革命性的改变，并由此开创了非水相生物催化（非水酶学）的新时代。 1 有机溶剂中酶催化反应的优势 研究表明，有机溶剂中的酶和水溶液中的酶一样具有高度的底物选择性。此外，还有以下一些特点[2, 3]: （1）绝大多数有机化合物在非水系统内溶解度很高；（2）根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统内进行；（3）有机溶剂可促使热力学平衡向合成方向（如酯合成、肽合成等）移动，如脂肪酶在水中催化脂肪水解，而在有机溶剂中则催化酯合成；（4）在有机溶剂中，所有有水参与的副反应（如酸酐水解）将受到抑制；（5）在有机溶剂中酶的热稳定性显著提高，可通过提高温度加速催化反应进行；（6）从非水系统内回收反应产物比水中容易；（7）在非水系统内酶很容易回收和反复使用，不需要进行固定化；（8）在有机溶剂中不易发生微生物污染；（9）更为重要的是，低水环境可用于稳定具有未知催化性质的构象异构体，以及在水中寿命极短的酶反应中间体。 目前，有机溶剂中酶催化的上述优势使得非水酶学研究成为生物化学、有机化学、生物工程等多种学科交叉的研究热点。迄今发现能在有机溶剂中发挥催化功能的酶有十几种，主要集中于脂肪酶研究，催化的反应类型包括氧化、还原、酯合成和酯交换、脱氧、酞胺化、甲基化、羟化、磷酸化、脱氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩合及卤代等。 2 影响酶催化活性的因素 一直以来有机相酶催化的研究非常活跃，但到目前为止仍处于实验研究阶段，离工业化应用还有一定的距离，最大的原因就是酶在有机溶剂中活性较低。一般而言，有机溶剂中的酶活性要比水溶液中低2-6个数量级。因此，确定影响有机溶剂中酶活性的因素，设法提高有机溶剂中酶活性表达是当今酶学研究的重点。 2.1必需水 有机溶剂中酶的催化必需在其分子周围有一单层水分子直接或间接地通过氢键、疏水键、静电作用、范德华力等以维持酶的活性结构，这部分水叫必需水[3]，所需水量因酶而异，表示方法也经历了多个阶段。非水酶学发展初期，普遍采用百分水含量来表示含水量，后来Halling[4]提出了热力学水活度a w这一表示方法，因为水解平衡时，各相的a w值相等；体系的改变伴随着水活度的变化，故通过a w值可以推断酶的活性。可通过液上气体与一干燥柱循环来调节反应介质液上水活度[5]；还可采用水活盐对来控制水活度，这种被普遍采用并行之有效。一些对水比较敏感的有机相酶促反应（如:肽的合成），可用水模拟物代替水，目前常用的水模拟物有甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃等，它们对水敏性酶促反应意义特别大。 2.2 有机溶剂
溶菌酶
溶菌酶 2010级基地班马冬珂10104109 一：溶菌酶的性质： １９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。（1） 溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的８—１，４键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解。是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。 二：提取原材料和提取方法: 溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中，一些植物（如卷心菜、木瓜等）的汁液中也有强力的溶菌酶活性。目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。 提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质， (2) 提取方法： １.蛋清中溶茵酶的提取：蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取，过程如下：蛋清过滤（９０目１００目），加入７２４型树脂吸附（每公斤蛋清加１５ｇ）一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。用质量分数１０％硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵（３０ｇ／１００ｍＬ）沉淀溶菌酶，沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取，即在蛋清中加入食盐（ＮａＣＩ）。使其质量分数达到５％，并调节溶液ｐＨ值至１０．０左右，加入少许溶菌酶晶体为晶种，于-４摄氏度冰箱冷却静置７ｄ一１４ｄ即可获得溶菌酶的结晶品。这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶，收率也比较高。可广泛用于从蛋清提取溶菌酶的工业化生产。 ２.蛋壳中溶茵酶的提取：蛋壳中（实际上是蛋壳膜）溶菌酶含量虽然较低，但从变废为宝的角度考虑，仍是提取溶菌酶的重要原料。具体工艺流程如下：蛋壳一质量分数１％ＮａＣＩ抽提滤液加热去除杂蛋白，加聚丙酸凝聚（富集），溶解凝聚物，加氯化钙沉淀上清液结晶。 三：制备（重点）： 1..酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热
有关酶催化的原理简介
有关酶催化的原理简介 酶的化学本质是蛋白质。具有酶活性的蛋白质分为简单蛋白质类和结合蛋白质类。简单蛋白质类的酶是由氨基酸组成的，不含任何其他物质，如胃蛋白酶。结合蛋白质类的酶是由简单蛋白质与辅基组成的，如乳酸脱氢酶、转氨酶。组成酶的简单蛋白质部分叫做酶蛋白或主酶，辅基部分叫做辅酶。一般是主酶与辅酶相结合，成为全酶，才能起到酶的作用。 降低反应活化能在任何化学反应中，反应物分子必须超过一定的能阈，成为活化的状态，才能发生变化，形成产物。这种提高低能分子达到活化状态的能量，称为活化能。催化剂的作用，主要是降低反应所需的活化能，以致相同的能量能使更多的分子活化，从而加速反应的进行。酶能显著地降低活化能，故能表现为高度的催化效率。通过过氧化氢酶的例子，可以显著地看出，酶能降低反应活化能，使反应速度增高千百万倍以上。 酶的催化作用机理现在普遍被接受的是Koshland DE提出的诱导契合学说（解释酶的专一性）和共价催化与酸碱催化（解释酶的高效率）。诱导契合认为，酶和底物结合咋接触以前并不是完全契合的，只有在底物被与酶的结合中心结合后，酶分子构象产生了微妙的变化（多加了个基团进去分子力不平衡，构象肯定是要变的），从而使催化中心的位置改变到底物附近并刚好有效作用于底物，从而底物得到催化。有些酶通过共价催化来加速催化速率，在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或吸收电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间配合物，这个中间物很容易变成转变态，因此反应活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。而酸碱催化是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态、加速反应的一种催化机制。 下面通过简述一篇关于生物酶催化合成生物柴油的文献来说明酶催化的过程和催化的特点。 这篇文献研究的背景是石化柴油的应用中所出现的一系列问题，针对这些问题采用动物或植物油脂与甲醇或乙醇进行反应合成脂肪酸单酯代替柴油，这种改性后的油脂（脂肪酸低碳醇酯）有着与柴油十分相似的理化性质，而且燃烧完全，无污染排放，称之为“生物柴油”。从生物柴油的制备原料来看，有着传统石化柴油不可比拟的优点，即原料可再生、产品本身环境友好、而且不用更换和经常清洗发动机等优点。目前生物柴油主要是用化学法生产，即动植物油脂与甲醇在高强度酸或碱催化剂下制备。化学法存在工艺复杂，醇消耗量大，产物不易回收，环境污染大等缺点。用脂肪酶代替酸碱催化剂催化合成生物柴油的报道已有很多，酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、产品易于收集、无污染物排放等优点，
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告 学院：生物科学与工程学院 班级： 姓名： 学号： 组别：第七组 组员：
一、实验内容： 溶菌酶的提取和系列性质测定 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。 本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。 二、实验原理： 1蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代
生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 2.柱层析技术 柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。 根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法 1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（）：184g柠檬酸和氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（L）：苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和丙酮，用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10% 尿素溶液和20ml PH 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作 与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验 试剂纯度和基质自身分解。
纤维素酶活力测定方法_张瑞萍
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
酶活性测定方法
酶活性测定 1、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲溶液(pH: 9.6)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.704 (Eu) 2、酸性磷酸酶(Acid phosphatase) 试剂：0.1% p-nitrophenylphosphate disodium salt（P-硝基苯磷酸二钠） 0.2mol/L HAc/Ac缓冲溶液(pH: 4.8)——buffer 0.2mol/L NaOH 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% P-硝基苯磷酸二钠及buffer 37°C孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL0.1% P-硝基苯磷酸二钠+2mL buffer 37°C孵化30 min； (3) 加入2mL 0.2mol/L NaOH终止反应； (4) 2500g 离心，上清液在410nm测定吸光度。 计算： 每个污泥样品酶活性的测定均包含两个平行样S+一个空白样品S0。 [(S1- S0)+(S2- S0)]/2*0.719 (Eu) 3、a-葡萄糖甘酶(a-glucosidase) 试剂：0.1% p-nitrophenyl a-D glucopyranoside（p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷） 0.2mol/L Tris-HCl (pH: 7.6) 测定步骤：(1) 加入样品之前，0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷及Tris-HCl 37°C 孵化30 min； (2) 1mL污泥样品+1mL 0.1% p-硝基苯-Α-D-葡吡喃糖苷+2mL Tris-HCl 37°C孵化
溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液(如淋巴液)、组织(如肝)、肾细胞内等[1]。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作用，是一种安全的天然防腐剂，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等[2]。 作为碱性酶的溶菌酶，其来源不同，水解细胞壁的性能也表现为较大差异[3]。溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖，作用位点是NAM与NAG碳原子间的β-1.4糖苷键[4]。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架)，是NAG 与NAM 通过 β-1，4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。肽聚糖结构中的任何化学键断裂，都能促使细胞壁中的肽聚糖分解，导致细菌细胞壁被破坏，从而体现溶菌酶的溶菌特性[6]。 近年来，根据不同原料及溶菌酶的特性，提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这一传统的方法，是由 Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶[7]。本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料，采用结晶法提取分离溶菌酶，进而利用重结晶的方法反复精制，可提取到所需纯度的溶菌酶晶体[8]。 1 实验 1.1 主要仪器、试剂与材料 1.1.1 主要仪器 UV-29200 紫外可见分光光度计；JJ-a 数控恒温磁力搅拌器；M304781 离心机；DSX-280B蒸气压力灭菌锅；KYC-111 摇床；SW-CJ-2F 超净工作台；FD-1B-50 冷冻干燥机；2X-15D 旋片式真空泵；R201 旋转蒸发仪；Sorvalls Upert-21 高速离心机；YP-5002 电子天平。 1.1.2 主要试剂 R-250、G-250考马斯亮蓝；NaH2PO4；Na2HPO4；1mol/L NaOH；20000 u/mg溶菌酶标准液；3g/L牛肉膏；营养肉汤；10g/L胰蛋白陈；微球菌； 5.1%的 NaCl溶液；HCl；CH3COOH；琼脂。 1.1.3 主要材料 新鲜湖光岩鹌鹑蛋，购置于湖光岩农贸市场。 1.2 实验方法 溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨 黄赞良，谈海玉，邓彩思，张兆霞*，李 泳* （广东海洋大学，广东 湛江 524088） 摘 要：以湖光岩鹌鹑蛋为原料，采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。探讨不同条件对溶菌酶收率及活性的影响，确定溶菌酶最佳的分离提取条件：盐析NaCl质量分数为5.1%，pH=10.7，盐 析时间为120h，收率达到 0.378%，酶活力达到 13700 U/mg。 关键词：盐析法；溶菌酶；酶活力 中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2017）05-083-04 _________________________ 收稿日期：2017-04-25 基金项目：广东海洋大学团队项目（项目编号：C13435）, 大学生创新创业项目（项目编号：CXXL2016152）。 作者简介：黄赞良，广东海洋大学，制药工程专业，大学生。 *通讯作者：张兆霞，李泳，广东海洋大学教师，从事生物酶相关方面的科研工作。
酶活性测定方法
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
生物酶法制备生物柴油
生物酶法制备生物柴油 摘要：石油资源日益匮乏，生物柴油已经成为国际新能源研究的热点。生产方 法以及生产原料成为生物柴油发展的两大瓶颈。生物柴油主要是以动植物油为原料，通过酯交换反应而制备的长链脂肪酸酯类物质。目前生物柴油的生产工艺主要有化学法和生物酶法。化学法是当前的主流工艺，但存在能耗高、工艺复杂、醇消耗量大、环境污染等缺点。生物酶法具有对原料中脂肪酸和水含量要求低、工艺简单、反应条件温和、选择性高、醇用量小、副产物少、生成的甘油容易回收且无需进行废液处理等优点,因而被认为是取代化学法生产生物柴油的绿色工艺。生物酶法包括游离脂肪酶催化法、离子液体脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法和细胞内脂肪酶催化法等。全细胞酶法弥补了脂肪酶的生产成本高、使用寿命短、易失活等不足，节省了设备和运行维护费用，成为了未来生物柴油制备的发展方向。收集餐饮废油和工业废油脂，发展高油作物和工程微藻，以此为原料生产生物柴油能够显著降低原料成本。改进传统生物柴油生产工艺，加快脂肪酶酯化工艺的研发，开发原料适应性广、酯化效率高、连续化、自动化程度高的环保经济新工艺，是目前生物柴油产业发展的核心。 关键词：生物柴油；生物酶法；全细胞酶法 1、生物柴油及其利用现状 生物柴油(Biodiesel)是指以植物、动物油脂等可再生生物资源生产的可用于压燃式发动机的清洁替代燃油。生物的柴油的制备过程是通过酯交换反应进行的，酯交换法是指通过酯基转移作用将高粘度的植物油或动物油脂转化成低粘度的脂肪酸酯，该过程需要一定的催化剂才能进行。生物柴油作为可再生清洁能源，具有优良的环保特性，无芳烃，含硫低，含氧高，可达11%，十六烷值高，燃烧性能好，润滑性好，闪点高，运输和使用安全等优点。因此，利用生物柴油作为新能源替代传统柴油，在环保和能源领域都有着非常深远的意义。 随着石油资源的日益匮乏，原油价格的不断攀升，生物柴油的优势尤为凸显，被国际可再生能源界誉为最具发展前景的替代油品，生物柴油的研究也已经成为国际新能源研究的热点。图1所示为2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量。 图 1 2003年至2008年全球生物柴油生产能力及实际产量
溶菌酶活性的测定
溶菌酶活性的测定 方法一 1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h， 2000r/min离心10min，取上层血清备用； 2.用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)配制成一定浓度的菌悬液（O.D.570=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）； 3.取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密 度值（A0）； 4.然后将试液移于37℃水浴30 min； 5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）； 6.计算。 公式： U=(A0-A)/A U：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值 方法二 1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h， 2000r/min离心10min，取上层血清备用； 2.用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)配制成0.2mg/ml的菌悬液； 3. 3.0 mL该悬液于离心管中，再加入40μl血清混匀，540nm下测初始光密度 值（A0）； 4.然后将试液移于28℃水浴30 min； 5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）； 6.计算。 公式： U=(A0-A)/A
U：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值 方法三 准确称取溶菌酶标准品，用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1ug/mL，，临用时用PBS稀释成500，100，50，25，10 ug/mL标准液，用以制成标准曲线。以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液（用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度为透光率达30％-40％）。O.D.530=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）。 取0.1 mL血清于小试管中，置28℃水浴锅中预热5 min，然后加入1.8 mL 已预热的菌液，立即计时，至2 min时加入2滴5 mol/LKOH溶液以终止反应，立即用0.5 cm比色杯于640 nm波长测其透光率T1％。取同样血清0.1 mL于1滴5 mol/L的KOH溶液中摇匀，28℃预热5 min后加入1.8 mL已预热的菌液，在同样温度下至2 min时同法测定其透光率T0％。T1％－T0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化。再从标准曲线上可查血清中溶菌酶含量。 附： A所需器材 离心管温箱移液枪枪头血凝板冰离心架722分光光度计水浴锅剪刀 B所需试剂 灭菌生理盐水:0.65% 0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)： 甲液：KH2PO49.08g/L 乙液：Na2HPO49.47g/L或Na2HPO42H2O 11.88 g/L 或Na2HPO47H2O 17.87g/L或Na2HPO4 12H2O 23.88 g/L pH6.4的PBS为：甲液73.5mL 乙液26.5ml
浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究
酿酒 HQUOR MAKING V01．30．No．2 Mar．，2OO3 文章编号：1002—8110(2003)02—0018一o4 浓香型大曲中酯化酶测定方法的研究 王耀，范文来，徐岩2，刁亚琴，陆红珍 (1．江苏洋河集团有限公司，江苏宿迁223725；2．江南大学生物i程学院，江苏无锡214036) 摘要：对浓香型大曲的酯化酶测定方法作了研究。建立有机相反应体系来代替传统方法的水相反应，与传 统测定方法(需反应100h)相比，它能简单、快捷检测大曲质量，适合工业化生产的要求。有机相中酯化反应 条件为：在30mL正庚烷有机反应介质中，35 的条件下，0．15M的底物酸，己酸与乙醇的浓度比为1：1．25，加 入15g(干曲)的大曲，仅用24h就能比较出大曲酯化力的高低。 关键词：浓香型，大曲，酯化酶，酯化，测定方法 中图分类号：TS262．31；TQ925 文献标识码：A‘ 0 前言 酯酶(Eaemse E．C．3．1．1．2)亦称羧基酯酶，是指可以水 解羧酯键的酶【lI4J。但该酶也能催化合成低级脂肪酸 酯Ll J。由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因 此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶[5-7 J。酵母、霉 菌、细菌中均含有酯酶[ ，6．。目前已经发现，红曲霉、根霉中 许多菌株有较强的己酸乙酯合成能力【5' 。 酯酶不同于脂肪酶。脂肪酶(缉磁e，E．C．3，1．1，3)是一 类特殊的酯酶，全称Tr／acy／g／ycerd acy／hydro／aseo脂肪酶的正 式名称是甘油酯水解酶。它既能将脂肪水解为脂肪酸和甘 油，又能催化脂肪的合成【5．9J。按Novo Nordisk公司的定义， 脂肪酶是可以水解一类特殊的酯类——三羧酸甘油酯的酶， 而酯酶则是可以水解羧酯键的酶【111。 对大曲酯化力的研究开始于20世纪8o年代后期[12,13J， 但广泛和深入的阐述大曲对浓香型酒生香的作用却是在20 世纪90年代[ 一·M一刮。 传统的酯化力测定方法【6J，是利用皂化反应和反滴定法 来测定。此法测定时间长，操作复杂。本文研究了利用有机 相代替水相的酯化酶活力的测定。 0．1 传统酯化力的测定【6J 6 先用碱中和酯化液中的游离酸，再加入一定量的碱使酯 皂化，过量的碱用酸进行反滴定，用酚酞作为指示剂。其反 应式为： RC00H +NaOH— ÷ RC00Na+ROH