HPLC法测定红树莓籽中鞣花酸含量
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安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40（ 18） ： 9659 － 9660
责任编辑 姜丽 责任校对 李岩
HPLC 法测定红树莓籽中鞣花酸含量
刘丽娜1 ，辛秀兰2* ，崔丽娟1
（ 1． 包头轻工职业技术学院乳品工程系，内蒙古包头 014045； 2． 北京电子科技职业学院生物技术系，北京 100029）
摘要 ［目的］利用高效液相色谱法（ HPLC） 测定红树莓（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） 籽提取物中鞣花酸的含量。［方法］色谱条件： ODS HYPERSL C18 柱（ 100． 0 mm × 4． 6mm，5 μm） ，柱温 25 ℃ ，流动相 CH3 OH － 0． 03% 三氟乙酸（ 体积比 50∶ 50） ，检测波长 254 nm，用外标法 测定鞣花酸含量。［结果］鞣花酸含量在 0． 322 ～ 8． 050 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系，r = 0． 999 5； 精密度试验 RSD 为 0． 69% ， 表明仪器精密度良好； 重现性试验 RSD 为 0． 95% ，表明方法的重现性良好； 平均加样回收率为 95． 32% ，RSD 为 1． 08% ，表明方法准确、 可靠，可用于后续分析。最后测得鞣花酸含量可达 994 mg / kg。［结论］红树莓籽中鞣花酸的含量高于所报道的红树莓果实中鞣花酸的 含量，可更进一步对其机理进行研究。 关键词 红树莓籽； 鞣花酸； 高效液相色谱法（ HPLC） 中图分类号 S 663． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2012） 18 － 09659 － 02
长为 254 nm。 1． 2． 5 方法学考察。 1． 2． 5． 1 线性关系考察。吸取对照品溶液，分别以 1、3、5、 10、15、20、25 μl 进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，鞣花 酸含量（ μg） 为横坐标进行回归。 1． 2． 5． 2 重现性试验。取同一红树莓籽样品 6 份，分别按 供试品溶液制备法制备提取物，测定鞣花酸峰面积，计算相 对标准偏差（ RSD） ，考察方法的重现性。 1． 2． 5． 3 精密度试验。精密吸取同一对照品溶液 10 μl，连 续重复进样 6 次，测定鞣花酸的峰面积，对同一供试样品按 拟定的方法作多次测定，计算 RSD，考察仪器的精密度。 1． 2． 5． 4 回收率试验。取已知含量的红树莓籽样品共 6
样品 1 2 3
Determination of Ellagic Acid Content in Red Raspberry（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） Seed by HPLC LIU Li-na et al （ Department of Milk Production and Engineering，Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou，Inner Mongolia 014045） Abstract ［Objective］ The purpose was to determined content of ellagic acid extracted from red raspberry seed by HPLC． ［Method］ The chromatography conditions were as follows： C18 column of ODS HYPERSL （ 100． 0 mm × 4． 6 mm at 5 μm） ，column temperature of 25 ℃ ， CH3 OH － 0． 03% trifluoroacetic acid （ volume ratio of 50 ∶ 50） as mobile phase and detection wavelength of 254 nm． ［Result］ The results showed that there was a good linearity between the peak area and the content of ellagic acid in the range of 0． 322 － 8． 050 μg（ r = 0． 999 5） ． Precision test’s RSD was 0． 69% ，showing instrument had good precision； Reproducibility test’s RSD was 0． 95% ，showing determination method had good reproducibility； Average recovery of sample was 93． 78% ，RSD was 1． 08% ，showing determination method was accurate and reliable，could be used in subsequent analysis． And finally，the content of ellagic acid extracted from red raspberry seed was up to 994 mg / kg． ［Conclusion］ The content of ellagic acid in red raspberry seed is higher than that reported in the red raspberry fruit and its mechanism should be further studied． Key words Red raspberry（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） seed； Ellagic acid； HPLC
图 2 红树莓籽样品色谱图
2． 1． 2 重现性。计算得样品中鞣花酸平均含量为 994 mg / kg， RSD 为 0． 95% ，表明仪器样品处理过程和测定方法均有良好 的重现性。 2． 1． 3 精密度。计算得对照品溶液的 RSD 为 0． 69% ，供试 品溶液的 RSD = 0． 29% ，表明仪器精密度良好。 2． 1． 4 回 收 率。计 算 平 均 回 收 率 为 95． 32% ，RSD 为 1. 08% ，表明方法准确、可靠，可用于后续试验。 2． 2 红树莓籽中鞣花酸的含量 由表 2 可知，样品 1、2、3 中 鞣花酸含量分别为 987、994、990 mg / kg，平均为 990. 3 mg / kg。 这表明红树莓籽提取物中鞣花酸的含量较高，且利用 HPLC 法测定其含量精确可靠。
mg，置于 25 ml 容量瓶中，用二甲基亚砜溶解并定容，经 0. 45
μm 微孔滤膜过滤，作为对照品溶液，备用。
1． 2． 4 液相色谱分离条件。色谱柱为 ODSHYPERSL C18 柱 （ 100. 0 mm × 4． 6 mm，5 μm） ； 流动相为 CH3 OH － 0． 03% 三氟 乙酸（ 体积比 50∶ 50） ； 流速为 1 ml / min； 柱温为 25℃ ； 检测波
份，精密称定，分别加入鞣花酸对照品约 25 mg，按供试品溶
表 2 红树莓籽中鞣花酸的含量
液制备方法制备加样供试品溶液，测定含量，计算 RSD，考察 方法的准确性及可靠性。 1． 2． 6 样品测定。取 3 批提取物，按上述供试品溶液制备 方法及色谱条件进行测定，以外标法计算含量。 2 结果与分析 2． 1 方法学考察结果 2． 1． 1 线 性 关 系。得 方 程 A = 4 010． 7 m － 4 671． 4，r = 0． 999 5。鞣花酸的含量在 0． 322 ～ 8． 050 μg 范围内与峰面 积呈良好的线性关系。鞣花酸标准品与红树莓籽样品色谱 图见图 1、2。
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安徽农业科学
2012 年
维生素 C） ，回流提取 60 min，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，
残渣用二甲基亚砜溶解，定容至 100 ml 容量瓶中。准确吸取
10 ml 该溶液于 50 ml 容量瓶中，用二甲基亚砜定容，经 0. 45
μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，备用。
1． 2． 3 对照品溶液的制备。精密称取鞣花酸对照品 8． 05
红树莓籽中鞣花酸的含量丰富，而目前还未见对红树莓籽中 鞣花酸提取研究的报道。为此，笔者利用 HPLC 对红树莓籽 中鞣花酸的含量进行了测定。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 研究对象。红树莓果，由北京汇源果汁饮料集团公 司提供。 1． 1． 2 主要试剂。鞣花酸对照品由北京裕华创新科技发展 公司提供（ 纯度 ＞ 95% ） ； 甲醇为色谱纯，由天津市西华特种 试剂厂生产； 盐酸、二甲基亚砜，由北京化工厂生产； 其余试 剂均为分析纯。 1． 1． 3 主要仪器。Agilent-1100 高效液相色谱仪，由美国安 捷伦公司生产； 电子分析天平，由奥豪斯国际贸易（ 上海） 有 限公司生产； 超声波清洗器（ KQ-100DE 型、40 kHz） ，由昆山 市超声仪器有限公司生产； 恒温水浴锅，由北京医疗设备厂 生产； 旋转蒸发器； 回流提取装置，由北京科学仪器厂生产； 粉碎机； 烘箱； 打浆机。 1． 2 方法 1． 2． 1 红莓籽的处理。用打浆机将红莓果打成均匀的浆 体，浆体可以用来加工果酱或果汁，将分离出来的红莓籽洗 净，低温烘干后用小型粉碎机粉碎至 40 目粒度备用。 1． 2． 2 供试品溶液的制备。称取粉碎后的红树莓籽粉 10 g （ 精确到 0． 000 1 g） ，用 100 ml 石油醚浸泡 2 h，在 125 W、50 ℃ 条件 下 超 声 处 理 25 min，过 滤，残 渣 称 重 后 按 照 1 ∶ 10 （ W / V） 的比例加 70% 丙酮（ 内含 1． 2 mol / L 的盐酸及 0． 2 g
树莓（ Rubus spp． ） 是重要的小果型经济灌木，被誉为新 兴的第 3 代果树。树莓属于蔷薇科悬钩子属，营养丰富而齐 全，如富含维生素 B2、钙、锌、镁等，尤其是维生素 C 的含量 是苹果的 5 倍，氨基酸及铁、锌、磷等含量高于苹果（ Malus domesica Borkh） 和葡萄（ Vitis amurensis） ，糖含量与苹果、梨 （ Pyrus spp． ） 、柑橘（ Citrus L． ） 三大水果相似［1］。鞣花酸广 泛存在于各种软果、坚果等植物中，是食子酸的二聚衍生物， 是一种多酚二内酯。红树莓籽所含的天然色素中就含有鞣 花酸类物质。由于鞣花酸对化学物质诱导癌变及其他癌变 有明显的抑制作用，且可以作为一种外源的抗氧化剂，还具 有凝血功能，可以作为一种凝血剂加以使用［2］。鞣花酸主要 以缩合形式（ 如鞣花单宁、苷等） 存在于自然界中，也能以游 离形式存在。鞣花酸对多种癌变有明显的抑制作用，具有抵 抗肺癌、食管癌和抗氧化［3］等作用。所以提取红树莓籽中的 鞣花酸并用于食品工业更具有现实意义。
鞣花酸含量分析方法有高效液相色谱法（ HPLC） 、反滴 定法和分 光 光 度 法 等。反 滴 定 法 的 操 作 过 于 烦 琐，费 时 费 力，使用的溶剂多，不适宜于工业生产中的产品分析； 分光光 度法需进行萃取，杂质的干扰影响大，测定结果误差也大［4］。
基金项目 作者简介
收稿日期
公益性行业（ 农业） 科研专项（ 201103037） ； 北京市职业院校 教师素质提高工程资助项目。 刘丽娜（ 1982 － ） ，女，内蒙古包头人，讲师，硕士，从事农产 品加工和乳品工艺研究，E-mail： liulina13 @ 163． com。* 通 讯作者，教授，博士，从事食品生产与加工 研究，E-mail： xiulanxin@ 163． com。 2012-02-16
责任编辑 姜丽 责任校对 李岩
HPLC 法测定红树莓籽中鞣花酸含量
刘丽娜1 ，辛秀兰2* ，崔丽娟1
（ 1． 包头轻工职业技术学院乳品工程系，内蒙古包头 014045； 2． 北京电子科技职业学院生物技术系，北京 100029）
摘要 ［目的］利用高效液相色谱法（ HPLC） 测定红树莓（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） 籽提取物中鞣花酸的含量。［方法］色谱条件： ODS HYPERSL C18 柱（ 100． 0 mm × 4． 6mm，5 μm） ，柱温 25 ℃ ，流动相 CH3 OH － 0． 03% 三氟乙酸（ 体积比 50∶ 50） ，检测波长 254 nm，用外标法 测定鞣花酸含量。［结果］鞣花酸含量在 0． 322 ～ 8． 050 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系，r = 0． 999 5； 精密度试验 RSD 为 0． 69% ， 表明仪器精密度良好； 重现性试验 RSD 为 0． 95% ，表明方法的重现性良好； 平均加样回收率为 95． 32% ，RSD 为 1． 08% ，表明方法准确、 可靠，可用于后续分析。最后测得鞣花酸含量可达 994 mg / kg。［结论］红树莓籽中鞣花酸的含量高于所报道的红树莓果实中鞣花酸的 含量，可更进一步对其机理进行研究。 关键词 红树莓籽； 鞣花酸； 高效液相色谱法（ HPLC） 中图分类号 S 663． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2012） 18 － 09659 － 02
长为 254 nm。 1． 2． 5 方法学考察。 1． 2． 5． 1 线性关系考察。吸取对照品溶液，分别以 1、3、5、 10、15、20、25 μl 进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，鞣花 酸含量（ μg） 为横坐标进行回归。 1． 2． 5． 2 重现性试验。取同一红树莓籽样品 6 份，分别按 供试品溶液制备法制备提取物，测定鞣花酸峰面积，计算相 对标准偏差（ RSD） ，考察方法的重现性。 1． 2． 5． 3 精密度试验。精密吸取同一对照品溶液 10 μl，连 续重复进样 6 次，测定鞣花酸的峰面积，对同一供试样品按 拟定的方法作多次测定，计算 RSD，考察仪器的精密度。 1． 2． 5． 4 回收率试验。取已知含量的红树莓籽样品共 6
样品 1 2 3
Determination of Ellagic Acid Content in Red Raspberry（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） Seed by HPLC LIU Li-na et al （ Department of Milk Production and Engineering，Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou，Inner Mongolia 014045） Abstract ［Objective］ The purpose was to determined content of ellagic acid extracted from red raspberry seed by HPLC． ［Method］ The chromatography conditions were as follows： C18 column of ODS HYPERSL （ 100． 0 mm × 4． 6 mm at 5 μm） ，column temperature of 25 ℃ ， CH3 OH － 0． 03% trifluoroacetic acid （ volume ratio of 50 ∶ 50） as mobile phase and detection wavelength of 254 nm． ［Result］ The results showed that there was a good linearity between the peak area and the content of ellagic acid in the range of 0． 322 － 8． 050 μg（ r = 0． 999 5） ． Precision test’s RSD was 0． 69% ，showing instrument had good precision； Reproducibility test’s RSD was 0． 95% ，showing determination method had good reproducibility； Average recovery of sample was 93． 78% ，RSD was 1． 08% ，showing determination method was accurate and reliable，could be used in subsequent analysis． And finally，the content of ellagic acid extracted from red raspberry seed was up to 994 mg / kg． ［Conclusion］ The content of ellagic acid in red raspberry seed is higher than that reported in the red raspberry fruit and its mechanism should be further studied． Key words Red raspberry（ Rubus corchorifolius Linn． f． ） seed； Ellagic acid； HPLC
图 2 红树莓籽样品色谱图
2． 1． 2 重现性。计算得样品中鞣花酸平均含量为 994 mg / kg， RSD 为 0． 95% ，表明仪器样品处理过程和测定方法均有良好 的重现性。 2． 1． 3 精密度。计算得对照品溶液的 RSD 为 0． 69% ，供试 品溶液的 RSD = 0． 29% ，表明仪器精密度良好。 2． 1． 4 回 收 率。计 算 平 均 回 收 率 为 95． 32% ，RSD 为 1. 08% ，表明方法准确、可靠，可用于后续试验。 2． 2 红树莓籽中鞣花酸的含量 由表 2 可知，样品 1、2、3 中 鞣花酸含量分别为 987、994、990 mg / kg，平均为 990. 3 mg / kg。 这表明红树莓籽提取物中鞣花酸的含量较高，且利用 HPLC 法测定其含量精确可靠。
mg，置于 25 ml 容量瓶中，用二甲基亚砜溶解并定容，经 0. 45
μm 微孔滤膜过滤，作为对照品溶液，备用。
1． 2． 4 液相色谱分离条件。色谱柱为 ODSHYPERSL C18 柱 （ 100. 0 mm × 4． 6 mm，5 μm） ； 流动相为 CH3 OH － 0． 03% 三氟 乙酸（ 体积比 50∶ 50） ； 流速为 1 ml / min； 柱温为 25℃ ； 检测波
份，精密称定，分别加入鞣花酸对照品约 25 mg，按供试品溶
表 2 红树莓籽中鞣花酸的含量
液制备方法制备加样供试品溶液，测定含量，计算 RSD，考察 方法的准确性及可靠性。 1． 2． 6 样品测定。取 3 批提取物，按上述供试品溶液制备 方法及色谱条件进行测定，以外标法计算含量。 2 结果与分析 2． 1 方法学考察结果 2． 1． 1 线 性 关 系。得 方 程 A = 4 010． 7 m － 4 671． 4，r = 0． 999 5。鞣花酸的含量在 0． 322 ～ 8． 050 μg 范围内与峰面 积呈良好的线性关系。鞣花酸标准品与红树莓籽样品色谱 图见图 1、2。
Biblioteka Baidu660
安徽农业科学
2012 年
维生素 C） ，回流提取 60 min，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，
残渣用二甲基亚砜溶解，定容至 100 ml 容量瓶中。准确吸取
10 ml 该溶液于 50 ml 容量瓶中，用二甲基亚砜定容，经 0. 45
μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液，备用。
1． 2． 3 对照品溶液的制备。精密称取鞣花酸对照品 8． 05
红树莓籽中鞣花酸的含量丰富，而目前还未见对红树莓籽中 鞣花酸提取研究的报道。为此，笔者利用 HPLC 对红树莓籽 中鞣花酸的含量进行了测定。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 研究对象。红树莓果，由北京汇源果汁饮料集团公 司提供。 1． 1． 2 主要试剂。鞣花酸对照品由北京裕华创新科技发展 公司提供（ 纯度 ＞ 95% ） ； 甲醇为色谱纯，由天津市西华特种 试剂厂生产； 盐酸、二甲基亚砜，由北京化工厂生产； 其余试 剂均为分析纯。 1． 1． 3 主要仪器。Agilent-1100 高效液相色谱仪，由美国安 捷伦公司生产； 电子分析天平，由奥豪斯国际贸易（ 上海） 有 限公司生产； 超声波清洗器（ KQ-100DE 型、40 kHz） ，由昆山 市超声仪器有限公司生产； 恒温水浴锅，由北京医疗设备厂 生产； 旋转蒸发器； 回流提取装置，由北京科学仪器厂生产； 粉碎机； 烘箱； 打浆机。 1． 2 方法 1． 2． 1 红莓籽的处理。用打浆机将红莓果打成均匀的浆 体，浆体可以用来加工果酱或果汁，将分离出来的红莓籽洗 净，低温烘干后用小型粉碎机粉碎至 40 目粒度备用。 1． 2． 2 供试品溶液的制备。称取粉碎后的红树莓籽粉 10 g （ 精确到 0． 000 1 g） ，用 100 ml 石油醚浸泡 2 h，在 125 W、50 ℃ 条件 下 超 声 处 理 25 min，过 滤，残 渣 称 重 后 按 照 1 ∶ 10 （ W / V） 的比例加 70% 丙酮（ 内含 1． 2 mol / L 的盐酸及 0． 2 g
树莓（ Rubus spp． ） 是重要的小果型经济灌木，被誉为新 兴的第 3 代果树。树莓属于蔷薇科悬钩子属，营养丰富而齐 全，如富含维生素 B2、钙、锌、镁等，尤其是维生素 C 的含量 是苹果的 5 倍，氨基酸及铁、锌、磷等含量高于苹果（ Malus domesica Borkh） 和葡萄（ Vitis amurensis） ，糖含量与苹果、梨 （ Pyrus spp． ） 、柑橘（ Citrus L． ） 三大水果相似［1］。鞣花酸广 泛存在于各种软果、坚果等植物中，是食子酸的二聚衍生物， 是一种多酚二内酯。红树莓籽所含的天然色素中就含有鞣 花酸类物质。由于鞣花酸对化学物质诱导癌变及其他癌变 有明显的抑制作用，且可以作为一种外源的抗氧化剂，还具 有凝血功能，可以作为一种凝血剂加以使用［2］。鞣花酸主要 以缩合形式（ 如鞣花单宁、苷等） 存在于自然界中，也能以游 离形式存在。鞣花酸对多种癌变有明显的抑制作用，具有抵 抗肺癌、食管癌和抗氧化［3］等作用。所以提取红树莓籽中的 鞣花酸并用于食品工业更具有现实意义。
鞣花酸含量分析方法有高效液相色谱法（ HPLC） 、反滴 定法和分 光 光 度 法 等。反 滴 定 法 的 操 作 过 于 烦 琐，费 时 费 力，使用的溶剂多，不适宜于工业生产中的产品分析； 分光光 度法需进行萃取，杂质的干扰影响大，测定结果误差也大［4］。
基金项目 作者简介
收稿日期
公益性行业（ 农业） 科研专项（ 201103037） ； 北京市职业院校 教师素质提高工程资助项目。 刘丽娜（ 1982 － ） ，女，内蒙古包头人，讲师，硕士，从事农产 品加工和乳品工艺研究，E-mail： liulina13 @ 163． com。* 通 讯作者，教授，博士，从事食品生产与加工 研究，E-mail： xiulanxin@ 163． com。 2012-02-16