多肽固相合成相关知识-博士精华之作

1. 多肽简介及化学合成多肽原理
蛋白质的基本结构单位是氨基酸，由20种氨基酸组成的各种各样的蛋白质。

每个氨基酸分子（脯氨酸除外）alpha碳原子上都结合一个-NH2、一个-COOH、一个氢原子，和一个各不相同的-R。

肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，是一个alpha-NH2和一个alpha-COOH脱水缩合而成的酰胺键。

一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽（peptide），由 2 个氨基酸缩合形成的肽叫二肽，由 3 个氨基酸缩合形成的肽叫三肽，少于10 个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽，如下图。

因此蛋白质的结构就是多肽链结构。

每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，称为羧基端或C-末端。

N R
2
n+
1
O
N
R
2
n+
2
O
OQ
1. 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去除氨基的保护基团。

2. 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。

活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。

在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。

循环：这两步反应反复循环直到合成完成。

3. 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA）洗脱和脱保护。

固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。

这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。

固相合成法对于肽合成的显著的优点：简化并加速了多步骤的合成；因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失；固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤未完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的重结晶或分柱步骤，可避免中间体分离纯化时大量的损失；使用过量反应物，迫使个别反应完全，以便最终产物得到高产率；增加溶剂化，减少中间的产物聚焦；固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应适宜。

固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物，必需通过可靠的分离手段纯化。

3.树脂的选择及氨基酸的固定
将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求：必须包含反应位点（或反应基团），以使肽链连在这些位点上，并在以后除去；必须对合成过程中的物理和化学条件稳定；载体必须允许在不断增长的肽链和试剂之间快速的、不受阻碍的接触；另外，载体必须允许提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。

用于固相法合成多肽的高分子载体主要有三类：聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物，这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上（第一个）氨基酸。

根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂或酰肼型树脂。

BOC合成法通常选择氯甲基树脂，如Merrifield树脂；FMOC合成法通常选择羧基树脂如王氏树脂。

氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基团之间形成的共价键来实现的，形成共价键的方法有多种：氯甲基树脂，通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有机溶剂如二氧六环、DMF或DMSO中反应；羧基树脂，则通常加入适当的缩合剂如DCC 或羧基二咪唑，使被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基树脂或酰肼型树脂，却是加入适当的缩合剂如DCC后，通过保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。

4.氨基、羧基、侧链的保护及脱除
要成功合成具有特定的氨基酸顺序的多肽，需要对暂不参与形成酰胺键的氨基和羧基加以保护，同时对氨基酸侧链上的活性基因也要保护，反应完成后再将保护基因除去。

同液相合成一样，固相合成中多采用烷氧羰基类型作为α氨基的保护基，因为这样不易发生消旋。

最早是用苄氧羰基，由于它需要较强的酸解条件才能脱除，所以后来改为叔丁氧羰基（BOC）保护，用TFA（三氟乙酸）脱保护，但不适用含有色氨酸等对酸不稳定的肽类的合成。

changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2
或哌啶-DMF脱去，近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。

羧基通常用形成酯基的方法进行保护。

甲酯和乙酯是逐步合成中保护羧基的常用方法，可通过皂化除去或转变为肼以便用于片断组合；叔丁酯在酸性条件下除去；苄酯常用催化氢化除去。

对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团所带来的副反应，一般也需要用适当的保护基将侧链基团暂时保护起来。

固相中的接肽反应原理与液相中的基本一致，将两个相应的氨基被保护的及羧基被保护的氨基酸放在溶液内并不形成肽键，要形成酰胺键，经常用的手段是将羧基活化，变成混合酸酐、活泼酯、酰氯或用强的失去剂（如碳二亚氨）形成对称酸酐等方法来形成酰胺键。

其中选用DCC、HOBT 或HOBT/DCC的对称酸酐法、活化酯法接肽应用最广。

裂解及合成肽链的纯化。

BOC法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，Fmoc 法裂解和脱侧链保护基时可采用弱酸.TFA为应用最广泛的弱酸试剂，它可以脱除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等；条件温和、副反应较少。

5.实例
例如合成H2N-Gly-Gly-Gly-Cys-Ser-Asp-Tyr-Asn-His-His-Trp-Cys-COOH 1、树脂的选择及活化处理
取二氯树脂1.5g 加入到用DCM 浸泡过的反应柱中, 用DCM 15 mL 浸泡30 min 使树脂充分膨胀, 以活化待用。

2、第一个氨基酸的连接
称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 0.31 g(依据为: 树脂量×取代度×氨基酸分子量×过量倍数)于DCM 中溶解, 再加入DIEA 0.5 mL, 混合加入反应容器中,吹N2反应2h, 将反应液过滤除去加入MeOH 5mL封闭反应1h后用DCM、DMF 各洗涤树脂3次。

3、脱除氨基保护基
加入约15 mL 20%哌啶的DMF 溶液反应5 min,滤掉, 再加入15 mL 反应20 min 后用DCM洗涤树脂3次、DMF 洗涤树脂3次。

4、肽键的形成
称取0.55 g Fmoc-Trp(boc)-OH, 0.35g TBTU 以DMF 溶解, 与0.6 mL
HOBt (2mol/L), 0.2 mL DIEA混合加入盛有树脂的反应容器中, 吹N2 反应2 h后用DCM洗涤树脂3次、DMF 洗涤树脂3次。

重复上述步骤(脱保护和接肽), 按还未成环前的直链肽的序列由羧基端→氨基端的顺序依次连接氨基酸。

5、侧链脱保护及环肽脱离树脂
洗涤、脱除最后一个氨基酸的Fmoc 保护后用N2将肽-树脂复合物吹干, 加入50 mL 小烧瓶中,按10 mL/0.5 mL/0.25 mL/0.5 mL/0.75 g 的比例加入TFA/苯甲硫醚/巯基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂。

室温磁力搅拌反应3 h 后, 过滤入冰乙醚中, 置冰箱2 h, 离心收集, 沉淀用纯水溶解, 再置冰箱冷冻,后将冻结的冰状物置真空冷冻干燥机, 冻干至恒重即得粗肽。

6.多肽的不稳定性
多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，其原因较多。

但对某一个多肽来说引起不稳定的主要原因并不多。

详细研究外界条件（如PH、温度、光照、氧浓度等）对多肽稳定性的影响有助于设计合理的制剂配方。

尽管添加剂稳定多肽的机制还不十分清楚，使用添加剂仍是目前提高多肽制剂稳定性的主要手段之一。

应用CD、DSC等分析手段可帮助快速筛选道合适的添加剂。

引起多肽不稳定的原因
1. 脱酰胺反应在脱酰反应中，Asn/Gln 残基水解形成Asp/Glu。

非酶催化的脱酰胺反应的进行。

在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。

2. 氧化多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。

在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。

氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。

3. 水解多肽中的肽键易水解断裂。

由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly 肽键。

4. 形成错误的二硫键二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。

5. 消旋除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。

其中Asp残基最易发生消旋应。

6. β-消除β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。

Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等残基都可通过β-消除降解。

在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。

7. 变性、吸附、聚集或沉淀变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。

在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。

在多肽变性过程中，首先形成中间体。

通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。

7.提高多肽稳定性的途径
（1）定点突变
通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性。

（2）化学修饰
多肽的化学修饰方法很多，研究最多的是PEG修饰。

PEG是一种水溶性高分子化合物，在体内可降解，无毒。

PEG与多肽结合后能提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。

选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。

（3）添加剂
通过加入添加剂，如糖类、多元醇、明胶、氨基酸和某些盐类，可以提高多肽的稳定性。

糖和多元醇在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，因而提高了多肽的稳定性。

在冻干过程中，上述物质还可以取代水而与多肽形成氢键来稳定多肽的天然构象，而且还可以提高冻干制品的玻璃化温度。

此外表面活性剂如SDS、Tween等能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。

（4）冻干
多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，水还可以作为其它反应剂的流动相。

另外，水含量降低可使多肽的变性温度升高。

因此，冻干可提高多肽的稳定性。