壳聚糖的酶解法降解及

（二）还原糖浓度的测定
在试管中加入1.0mL 降解后的 壳聚糖溶液和4.0mL显色剂，摇 匀；
塞上塞子，在沸水浴中加热 15min；
冷却，8000r/min离心10min;
取 清 液 ， 在 波 长 420nm 处 ， 以 蒸 馏 水 做 空白，测定吸光度A。再取1.0mL 蒸馏 水加4.0mL显色剂，测其420nm处的吸光 度A0。
公用：
N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准溶液（1.2mmol/L）
100mL 1瓶
量筒
250mL 2个（取缓冲液用）
今天实验具体内容：
1、配制N-乙酰-D-氨基葡萄糖的系列标准溶液 2、测其吸光值 3、配制乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6) 4、配制底物溶液和酶液，然后开始酶解反应 5、实验后：总结结果、写实验报告
OD420
15
30
45
60
80
100
120
140
△A=A0-A
稀释倍数
还原糖浓度 （mmol/L）
3、绘制酶反应进程曲线
根据Table 2，以测得的还原糖浓度对反应时 间作图，得酶反应进程曲线，直线线段的斜率就 是反应初速度。
七 实验报告
■实验原理、实验目的、实验仪器设备、 实验流程、现象等 ■结果记录和数据处理（包括酶反应进 程曲线和反应初速度值）
二 实验目的
1． 了解酶水解壳聚糖的原理和方法 2． 加深对酶促反应过程和其应用的认识 3． 掌握还原糖浓度的测定方法 4． 掌握反应初速度的测定
三 实验主要材料
1、木瓜蛋白酶 2、壳聚糖 3、N-乙酰-D-氨基葡萄糖 4、铁氰化钾 5、紫外分光光度计 6、控温摇床 7、离心机 8、水浴锅 9、电炉
附：乙酸-乙酸钠缓冲溶液的配制
pH
甲液X(mL)
乙液Y(mL)
pH
甲液X(mL)
3.6
46.3
3.7
4.8
20.0
乙液 Y(mL)
30.0
3.8
44.0
6.0
5.0
14.8
35.2
4.0
41.0
9.0
5.2
10.5
39.5
4.2
36.8
13.2
5.4
8.8
41.24.4源自30.519.55.6
4.8
计算△A=A0-A，根据标准曲线方程得 出还原糖的浓度。
六 实验结果的记录 和数据处理
1、标准曲线的绘制
Table 1
标准溶液浓度 0 （mmol/L）
OD420
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
△A=A0-A
0
拟合的标准曲线方 程
2、壳聚糖酶解反应过程结果记录
Table 2
反应时间
0
（min）
45.2
4.6
25.5
24.5
甲液 0.2mol/L醋酸 乙液 0.2mol/L醋酸钠 根据要求的pH值，按上表所示，吸取XmL甲液和YmL乙液混匀即得。
注意事项
1、酶水解时，取样后应立即灭活酶 2、测酶解液还原糖浓度时，有时需稀 释 3、细心、耐心 4、爱护仪器
本实验安排
●标准曲线的绘制（Table 1) ●酶水解反应进程曲线（ Table 2，并绘图)
3、壳聚糖的酶水解
将壳聚糖溶液加入锥形瓶中，置于控温摇 床（45℃，120 rpm）中。20min后，取出 1mL，测其还原糖浓度，作为反应起始点的 还原糖浓度。加入1mL木瓜蛋白酶溶液开始 降解。
每隔15min取出1mL，95℃水浴15min 使酶灭活,然后测定还原糖浓度。第2 个小时开始每20min取一次样，测其还 原糖浓度。当OD值小于0.1时，应适 当稀释。反应2小时后结束实验。
四 实验步骤
1、壳聚糖溶液的配制
称 2 g壳聚糖于250mL烧杯中，加入200 mL的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=4.6），不断 地进行搅拌，直至完全溶解。
2、木瓜蛋白酶溶液的制备
取12 mg的木瓜蛋白酶于5mL离心管中， 加入1 mL pH=4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液， 在旋涡振荡器上振荡使其溶解，保存待用。
共分7组 2人/组
每组实验台配备（共7组）
试管架 试管 5mL离心管 移液管 玻棒 1mL滴管 吸耳球 烧杯 锥形瓶 碱性铁氰化钾溶液
1个 20mL 10支（配制标准溶液和装样用） 10个 1mL、5mL各2支 1根 1只（取样用） 2只 250mL 2个 250mL 1个（反应用） 150mL（显色剂）
分别取1.0mL，加入4.0mL显色剂，摇匀。
塞上塞子，在沸水浴中加热15min。
冷却，在波长420nm处，以蒸馏水做空白，测 定吸光度A。再取1.0mL 蒸馏水加4.0mL显色 剂，测其420nm处的吸光度A0。
计算△A=A0-A，得到一系列对应不同浓度N乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的△A值。以△A值对 N-乙酰-D-氨基葡萄糖溶液的浓度作图，得标 准曲线。
实验三
壳聚糖的酶解法降解及 其动力学
一 实验内容
以木瓜蛋白酶催化降解壳聚糖， 并考察这一酶促反应过程的动力学
壳聚糖
壳聚糖的酶降解
OH
OH
OH
OH
O O
O O
O O
O O
HO
HO
HO
HO
N H2
N H2
N H CO CH3
N H2
降解产物低聚壳聚糖
可有效地降低血压、血糖和血脂； 增强免疫力和抗疾病的能力；调 节肠道的微生物生态平衡等。
五 方法
还原糖浓度的测定采用Imoto改良法。 显色剂：称取0.5g铁氰化钾，溶解于1L 0.5mol/L的碳酸钠溶液中，然后存放于棕色瓶 中。
（一）还原糖标准曲线的绘制
准确配制0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.6mmol/L， 0.8mmol/L，1.0mmol/L和1.2mmol/L的N-乙酰D-氨基葡萄糖标准溶液。