鸡蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究_杨瑾

现代食品科技Modern Food Science and Technology2011, Vol.27, No.12
1446 鸡蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究
杨瑾，唐传核
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）
摘要：本试验研究了利用Alcalase酶解鸡蛋清蛋白制取水解度为5~15%的酶解物并对其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原力进行了测定，同时对不同水解度的水解物的溶解度、表面疏水性和总游离巯基含量进行了测定。

结果表明，酶解产物具有较低的表面疏水性和总游离巯基含量，同时DPPH自由基清除能力在最大蛋白浓度1.0 mg/mL处降低了约50%。

但是酶解却显著增大了羟基自由基清除能力和还原力，水解度为15%时羟基自由基清除力和还原力在其试验最大蛋白浓度处较未酶解的EWP均增大了约一倍。

关键词：蛋清蛋白；酶解物；碱性蛋白酶；抗氧化性质
文章篇号：1673-9078(2011)12-1446-1450
Antioxidant Properties of Chicken Egg White Protein Hydrolysates
YANG Jin, TANG Chuan-he
(College of Light Industry & Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: The antioxidant properties of the hydrolysates, obtained by hydrolysis with Alcalase from chick egg white proteins (EWP) at degree of hydrolysis (DH) of 5%-15 % were characterized. The tested properties, including DPPH and hydroxyl radical scavenging abilities, as well as reducing power, and protein solubility (PS), surface hydrophobicity (H o) and free sulphydryl group content were also evaluated. These hydrolysates exhibited much lower H o and total free SH content. The hydrolysis greatly decreased the DPPH radical scavenging ability about 50% at the highest concentration of 1.0 mg/mL. In addition, the hydrolysis significantly increased hydroxyl radical scavenging ability and reducing power about 15% at their highest concentration.
Key words: egg white proteins (EWP); hydrolysate; Alcalase; antioxidant property
鸡蛋清蛋白含有人体所必需的多种氨基酸,且氨基酸组成配比均衡性好,是机体利用率最高的一种蛋白质[1]。

目前鸡蛋清蛋白是食品工业中重要的成分配料，具备多种功能性质如起泡性、乳化性、凝胶性等，是食物中最优质的蛋白质之一[2]。

为了开拓蛋品资源加工新途径，提高蛋品的高附加值，酶解改善蛋清蛋白性质将是一个很好的研究方向。

资料表明，蛋清白蛋白经蛋白酶适度水解，生成多肽的混合物，通过控制其水解度，可提高蛋白的收率，生成的多肽混合物也更有利于人体吸收[1]。

同时蛋清蛋白经过蛋白酶水解后，其分子量降低，蛋白质的功能特性得以改善，溶解性提高，粘性、热凝固性降低，蛋白质的致敏性降低，使其更易于消化，并能产生抗氧化、降血脂、降血压等生理活性的小分子肽[3,4]。

本文通过Alcalase酶解鸡蛋清蛋白制备不同水解度的水解物，重点研究酶解后蛋清蛋白的抗氧化活性收稿日期：2011-08-02
作者简介：杨瑾（1987-），女，硕士研究生
通讯作者：唐传核，副教授 及相关物化性质，对提高蛋清的综合利用价值以及人类的健康具有十分重要的作用。

1 材料和方法
1.1 实验材料与仪器
鸡蛋清蛋白，冷冻干燥制取；Alcalase酶制剂，诺维信公司；DPPH，Sigma公司；Ferrozine，ULTRA 上海生工生物技术服务有限公司；FeCl2·4H2O，天津科密欧化学试剂有限公司；铁氰化钾，天津科密欧化学试剂有限公司；NaOH，天津科密欧化学试剂有限公司；Tris，北京鼎国生物技术有限公司；三氯乙酸，广州化学试剂厂；CR22G高速冷冻离心机，日本日立公司；高效液相色谱仪Waters1525，美国Waters公司；荧光分光光度计F-7000，日本日立公司；紫外-可见分光光度计2501PC，日本岛津公司。

1.2 实验方法
1.2.1 水解产物的制备
鸡蛋清蛋白溶于去离子水配制3%（m/V）蛋白溶液，在沸水浴30 min后，迅速冷却至最佳温度55 ℃，于55 ℃水浴中保温10 min，调pH至8.0，加入Alcalase
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.12.019
酶（底物蛋白与酶的比例为100:2，m/V）后于55 ℃摇床反应，酶解过程中，每隔30 min通过滴加0.5 M NaOH使反应体系的pH值保持在8.0，并记录消耗的NaOH体积。

并于水解度为5%，10%，15%时，取样于90 ℃水浴灭酶10 min，在冰水中迅速冷却后调pH 值7.0并离心（4000 g，20 min，20 ℃），上清液冻干既得5%，10%，15%的三种酶解产物。

1.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
根据Laemmli[5]的方法，在不连续缓冲液系统上进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶和浓缩胶质量分数分别为15%和5%。

用SDS-PAGE样品缓冲液（含质量分数为5%的β-巯基乙醇和10%的SDS）配制4%样品溶液（2 mg蛋白样品/0.5 mL缓冲液），充分震荡混合均匀，电泳前沸水加热处理5 min，离心（8000 g，5 min），进样量5 μL。

凝胶电泳于恒定电流下进行，在浓缩胶处电流保持40 mA，分离胶处增至80 mA。

凝胶染色及脱色后，于凝胶成像系统进行成像处理。

1.2.3 高效体积排阻色谱（HPSEC）分析
采用Waters高效凝胶液相色谱（HPLC）系统：Waters 1525泵，检测器为 Waters 2487双波长紫外吸收检测器，高效凝胶柱为TSK-GELG2000SWXL （0.78 × 30 cm, Tokyo, Japan）柱，保护柱为Protein-PakTM 125 (0.6 × 4 cm, Tokyo, Japan）。

待测样浓度1%（m/V），以含50 mM NaCl的磷酸缓冲液（50 mM PBS, pH 7.2）配制，于10000 g离心10 min，取上清液过膜（0.45 μm）分析。

凝胶柱用洗脱剂（磷酸缓冲液）平衡后即可上样，流速为0.75 mL/min，进样量10 μL，于280 nm波长下检测并记录洗脱峰，数据分析采用Breeze软件（Waters, Division of Millipore, Milford, MA, USA）。

1.2.4 表面疏水性（Ho）
Ho测定参考Haskard等[6]的方法。

用0.01 M磷酸缓冲液配制1.5%（m/V）蛋白原液，并配制8.0 mM ANS-（荧光探针）溶液。

测定前，取4 mL磷酸缓冲液，加入10，20，30，40，50 μL的1.5%的蛋白原液，在测试前添加20 μL of ANS-溶液，充分震荡后立即于F4500荧光光谱仪测定荧光强度（Hitachi Co., Japan），激发波长390 nm，发射波长470 nm，激发和发射夹缝宽均为5 mm。

以最大荧光强度为纵坐标，蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，通过线性回归分析得到的斜率即为Ho。

1.2.5 暴露巯基和总巯基含量测定
巯基含量测定采用经Beveridge改进后的Ellman[7]法，稍作改动。

Ellman,s试剂的配制将4 mg的DTNB 溶入1 mL的Tris-glycine缓冲溶液（0.086 M Tris，0.09 M glycine，0.04 M EDTA，pH 8.0）。

其中总巯基的测定将15 mg蛋白溶入5.0 mL的加入尿素浓度为8 mM的Tris-glycine溶液中，而游离巯基含量的测定即将15 mg蛋白加入不含尿素的5.0 mLTris-glycine溶液中。

然后加入50 mL的Ellman,s试剂，混合液在25o C 的室温中静置1 h，在10,000g下离心10 min。

取上清液于412 nm比色，以缓冲溶液作为空白。

游离巯基含量可用以下公式计算：
SH (μM/g)=(73.53×A412×D)/C
注：其中D为稀释常数，C为蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.6 还原力
还原力的测定参考Oyaizu等[8]建立的方法：10 mL不同浓度梯度的样品溶液（0~5 mg/mL），加入2.5 mL 0.2 M磷酸缓冲液（pH 6.6）、2.5 mL浓度为1 %的K3（CN）6，于50℃的水浴锅中反应20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10 %（m/V）的TCA溶液，离心（3000 g，10 min，20 ℃）后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 去离子水和0.5 mL浓度为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀后静置10 min，于700 nm处测定吸光值，吸光值越大，说明样品的还原力越强。

1.2.7 羟自由基清除能力
羟自由基清除能力的测定方法参考Avellar[9]的方法，具体如下：用50 mM磷酸缓冲液配制含有0.75 mM 邻二氮杂菲（1,10-phenanthroline）和0.75 mM FeSO4的溶液（pH 7.4），用其配制不同浓度梯度的样品溶液（0~1.0 mg/mL）4 mL，分别加入2 μL双氧水（30%，m/V），37 ℃水浴中反应60 min后，于536 nm波长下测定吸光度值。

清除能力由公式（2）计算，式中，A S为样品的吸光度值；A1为对照样吸光值（含邻二氮杂菲、FeSO4和H2O2，但不含样品）；A0为空白样的吸光度值（仅含邻二氮杂菲和FeSO4）。

OH自由基清除力(%)= [(A S-A1)/(A0-A1)]×100
1.2.8 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基清除能力的测定参考Shimada等[10]的方法：配制浓度为1 mg/mL蛋白贮液，稀释成浓度为0、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/mL的样品溶液各2 mL，加入0.2 mmol/mL的DPPH乙醇溶液（现配）2 ml，振荡摇匀，在室温下放置30 min后，以无水乙醇为空白，于517 nm处测定吸光值，计算公式见式（3），式中，A S为样品溶液对应吸光度值；A b为蒸馏水（0 mg/mL）对应吸光值。

DPPH清除率(%)=[1-(AS/Ab)]×100
吸光值越小，代表其清除DPPH能力越强。

2 结果与分析
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2.1 蛋清蛋白酶解过程分析
Alcalase水解蛋清蛋白时，随着水解时间的推移，水解度逐步上升。

在最初水解时，水解速度上升比较快，随着水解的进行，使得水解速度逐渐减慢。

在该实验中制备了水解度为5%、10%和15%的酶解产物。

图1 蛋清蛋白及其不同水解度（5，10和15%）酶解产物的的
SDS-PAGE（a）和SEC（b）图
Fig.1 SDS-PAGE (A) and SEC (B) profiles of EWP and its
hydrolysates with various DH values (5, 10 and 15 %)
图1中电泳图和SEC图进一步表征了酶解过程。

图1a显示未处理蛋清蛋白EWP上分子量约为40 kDa 处有清晰条带，另外分子量为78 kDa和14.3 kDa处也有较为清晰的条带，三条主要条带分别对应于蛋清白蛋白、卵运铁蛋白、溶菌酶。

而最顶端出现的那条带则可能是由于严重的热处理导致蛋清蛋白分子形成了大分子聚集物。

该结果与2003年Campbell等研究中蛋清蛋白的电泳图[11]带相一致。

而电泳图谱上三种水解度的酶解物都没有出现条带，原因可能是由于经过酶解蛋清蛋白变成了分子量小于10 kDa的小分子肽段，该结果表明热处理后的蛋清蛋白再经水解非常容易形成小分子肽段。

由图1b中SEC图观察到未经处理的EWP在10.16 min和11.46 min处为两个主要的洗脱峰I和II，另外在15.17 min处为一个小吸收峰III。

该结果与2011年Nicorescu等的研究结果[12]相一致。

峰I由蛋清白蛋白低聚物所形成，而峰II是由卵运铁蛋白和蛋清白蛋
白所组成，而小峰III则可能是由溶菌酶组成。

而酶解几乎造成了主要峰I和峰II的全部消失，而在15~20 min内则出现了洗脱峰。

而该结果与电泳图结果相一致，进一步证明了经过酶解蛋清蛋白主要成份几乎全部被酶解成小分子。

由15~20 min之间的洗脱峰相比较得出，随着DH从5~15%增大时其对释放出的多肽的分子量在逐渐减小。

而且，根据对未处理的EWP 和三种水解物洗脱峰面积的计算和比较，水解物的洗脱峰面积相对于为处理的EWP有较多的增加，但对于三种酶解物面积没有明显的区别。

洗脱峰面积的增加可以间接证明了电泳图上出现的大分子难溶聚集物的存在，但是在SEC实验中，这种聚集物在分析之前由于离心和过膜被去除未能在SEC图上出现。

2.2 表面疏水性（H o）
表1 蛋清蛋白及其水解物的表面疏水性（H o），游离巯基含量（总巯基和暴露巯基含量），溶解度（pH 7.0）
Table 1 Surface hydrophobicity （H o）, free SH contents （total and exposed），Protein Solubility （%）of EWP and its hydrolysates（PH 7.0）. Each data is the means and standard deviations of triplicate measurements
Free SH contents
（μM / g sample）
Samples Ho
Exposed Total
Protein
Solubility/% EWP(control)2116.04±5.9d8.70±0.4a 81.37±0.5d50.01±0.3a DH 5% 792 .04±4.0c14.83±0.5d 24.88±0.6c78.62±0.4b DH 10% 337.61±6.3b11.89±0.3c 18.38±0.9b85.23±0.2c DH 15% 241.93±9.1a10.05±0.4b 15.07±0.3a86.50±0.4d 注：三次测定的结果以“平均值（标准偏差）”表示。

a~d 表示同一列数值间有显著性差异（p<0.05）。

EWP及其水解物（5，10 and 15% DH）的表面疏水性H o在中性条件下使用荧光探针测定得出。

如表1所示，水解物DH从0增加到15%时，其对应的表面疏水性H o从2116剧烈下降到了242。

酶解导致H o的剧烈下降的原因一方面归因于酶诱导蛋白质表面疏水性区域的断裂；另一方面由于在酶解之后，一些疏水性多肽或片段在离心过程中被去除。

该结果与2009年Tang等对荞麦蛋白水解物的研究结果[13]相类似。

2.3 游离巯基含量
由表1可知，未经处理过的EWP的游离巯基总量约为81.4 μM/g，其中暴露巯基含量占总巯基含量的11%，这个现象可以解释为蛋清蛋白中的主要成分蛋清白蛋白中含有较多的游离巯基集团[14]。

酶解处理导致总巯基含量下降了70~80%，且水解度越高，下降幅度越大。

相反的，在水解物中暴露巯基在总巯基含量所占百分比不同程度地高于EWP。

总巯基含量的大
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量降低可能由于酶解解除了游离巯基集团的空间阻碍，进而促成了游离巯基间二硫键的形成。

另外，巯基氧化反应也可以部分解释这个现象。

2.4 抗氧化性能
2.4.1 还原力
图2 EWP及EWP酶解产物还原力
Fig.2 Reducing power of EWP and hydrolysates
注：竖直误差线为三次测定的标准偏差。

还原力是衡量抗氧化剂供电子能力的指标，测定机理为：抗氧化剂可作为电子供体充当还原剂，将铁氰化钾K3Fe(CN)6中的Fe3+还原为Fe2+，使溶液产生普鲁士蓝色，产物溶液于700 nm下测定的吸光值可以反映样品还原力的大小，颜色越深、吸光值越高说明的被测样品的还原力越强。

蛋清蛋白酶解物的还原力如上图2，以常见抗氧化剂抗坏血酸（Vc）为参比。

由图2可知所有被测样的还原力均与浓度呈线性相关。

酶解产物的还原力强于未处理EWP的还原力值0.386，且水解度为5%时其对应产物的还原力达到最大值与EWP相比增长81%，水解度继续增大时，还原力有所降低。

当样品浓度为5.0 mg/mL时蛋清蛋白水解物的还原力在0.56~0.70之间，高于2007年研究中血红蛋白水解物为0.08~0.25之间[15]，但是却稍低于鹰嘴豆水解物[16]。

还原力增强的原因可能是由于酶解导致含特定供电子基团片段的暴露，比如暴露巯基含量的增加（如表1）。

2.4.2 羟基自由基清除能力
图3中评估了酶解产物及未酶解EWP的羟自由基清除率，参比为BHT。

所有被测样的清除率均与样品浓度（0~1.0 mg/mL）呈现出良好的线性相关性。

由图3、4可知未处理EWP的羟基自由基抑制率在所有浓度下均大于其DPPH自由基抑制率。

这证明了具有高表面疏水性的EWP相比水溶性自由基更容易清除脂溶性自由基。

与DPPH自由基清除率不同的是，酶解处理使得羟基自由基清除能力增强，尤其在浓度大于0.4 mg/mL时更为明显，而清除能力的增强主要是与EWP经酶解后亲水性或者溶解性增强有关（如表1）。

图3 EWP及EWP酶解产物羟基自由基清除能力 Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of EWP and
Hydrolysates
注：竖直误差线为三次测定的标准偏差。

2.4.3 DPPH自由基清除能力
图4 EWP及EWP酶解产物DPPH自由基清除能力
Fig.4 DPPH radical scavenging ability of EWP and
Hydrolysates
注：竖直误差线为三次测定的标准偏差。

图4比较了酶解产物及未酶解EWP在清除DPPH 自由基方面的活性，检测浓度为0~1.0 mg/mL，以常见抗氧化剂BHT（2,6-二叔丁基对甲酚）为参比。

所有检测样的DPPH清除力均与样品浓度呈现出较好的线性关系，当浓度小于0.4 mg/mL时，抑制率呈较快增长，但当浓度大于0.4 mg/mL时，增长速率变得缓慢。

而DPPH自由基抑制率越高，表明样品的DPPH 清除能力越强。

当浓度达到1 mg/mL时，抑制率达到22%。

该数值略低于2007年研究中血红蛋白浓度为2.0 mg/mL时的DPPH抑制率[15]。

另外，所有的水解物的DPPH自由基抑制率均小于未处理的EWP，在浓度大于0.2 mg/mL时尤为明显。

但各水解物的清除DPPH能力却没有明显区别。

结果表明，EWP经过酶解DPPH自由基清除能力有明显降低。

由以往研究可知，蛋白水解物的清除能力通常与疏水性氨基酸或表面疏水性相关[17]。

因此，蛋清蛋白水解物自由基清除能力降低的原因一方面是酶解导致
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了表面疏水性的显著性下降，另一方面则可能是酶解导致了总游离巯基含量（表1）的大量下降。

3 结论
鸡蛋清蛋白经过酶解后蛋清蛋白具有较低的表面疏水性和游离巯基含量，但是溶解度大幅度提高，最高溶解度值可达86.50%。

酶解产物的DPPH自由基清除能力有所降低，但羟基自由基清除能力和还原力有明显地提高，分别在最大值处较未处理的EWP提高了约一倍。

这些结果表明蛋清蛋白酶解物是一种优良的水溶性抗氧化剂，同时由于其具备高溶解性，使得鸡蛋清蛋白在食品配方的应用上具有巨大的潜力。

参考文献
[1]郑云,蔡木易,范慰慰.蛋清白蛋白酶解工艺的研究[J].生产
与科研经验,2005,31(12):69-71
[2]于滨,迟玉杰.糖基化改善蛋清蛋白功能性的研究[J].中国
家禽,2009,31(7):15-18
[3]陈杰,马美湖.风味蛋白酶水解蛋清工艺条件的研究[J].现
代食品科技,2007,23(7):43-47
[4]周利亘,王君虹,张治国,陈新峰,冯凤琴,刘相真. 中性蛋白
酶水解蛋白蛋白的工艺[J].浙江农业科学,2011,2:335-337 [5]Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4 [J]. Nature, 1970,
227: 680-685
[6]Haskard C A, Li-Chan. Hydrophobicity of bovine serum
albumin and ovalbumin determined using uncharged (Prodan)
and anionic (ANS-) fluorescent probes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 2671-2677
[7]Ellman G D. Tissue sulfhydryl groups [J]. Archives of
Biochemistry and Biophysics, 1959, 82: 70-72
[8]Oyaizu M. Studies on products of browning reaction:
Antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine [J]. Japanese Journal of Nutrition, 1986, 44: 307-315
[9]de Avellar I G, Magalhaes M M, Silva A B. Reevaluating the
role of 1,10-phenanthroline in oxidative reactions involving ferrous ions and DNA damage [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2004, 1675: 46-53
[10]Shimada K, Fujikawa K, Y ahara K. Antioxidative properties
of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin
emulsion [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
1992, 40: 945-948
[11]Campbell L, Raikos V, & Euston R. Modification of functional
properties of egg-white proteins [J]. Nahrung/Food, 2003, 47: 369-376
[12]Nicorescu C, Vial E, Talansier V, Lechevalier C, Loisel D.
Comparative effect of thermal treatment on the physicochemical properties of whey and egg white protein
foams [J]. Food Hydrocolloids, 2011, 805: 797-808
[13]Tang C H, Peng J, Zhen D W, Chen Z. Physicochemical and
antioxidant properties of buckwheat (Fagopyrum esculentum
Moench) protein hydrolysates [J]. Food Chemistry, 2009, 2:
1-7
[14]Y oshinori Mine. Recent advances in the understanding of egg
white protein functionality [J]. Trends in Food Science &
Technology, 1995, 225:225-231
[15]Chang C Y, Wu K C, Chiang S H. Antioxidant properties and
protein compositions of porcine haemoglobin hydrolysates
[J]. Food Chemistry, 2007, 115: 1537-1543
[16]Li Y, Jiang B, Zhang T, et al. Antioxidant and free
radicalscavenging activities of chickpea protein hydrolysate
(CPH) [J]. Food Chemistry, 2008, 106: 444-450
（上接第1436页）
[10]Huebner F, Wall J. Polysaccharide in teractions with wheat
proteins and flour dough [J]. Cereal Chem, 1979, 56: 68-73 [11]S Krzyztof. Effect of protein hydrolyse on the instrumental
texture profile of gelatin gels [J]. Journal of texture studies,
1997, 28: 289-393
[12]M Pons. Instrumental texture profile analysers with particular
reference to gelled system [J]. Journal of texture studies, 1996, 27: 597-624
1450。