鸡蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究_杨瑾

现代食品科技Modern Food Science and Technology2011, Vol.27, No.12

1446 鸡蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究

杨瑾，唐传核

（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）

摘要：本试验研究了利用Alcalase酶解鸡蛋清蛋白制取水解度为5~15%的酶解物并对其DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、还原力进行了测定，同时对不同水解度的水解物的溶解度、表面疏水性和总游离巯基含量进行了测定。结果表明，酶解产物具有较低的表面疏水性和总游离巯基含量，同时DPPH自由基清除能力在最大蛋白浓度1.0 mg/mL处降低了约50%。但是酶解却显著增大了羟基自由基清除能力和还原力，水解度为15%时羟基自由基清除力和还原力在其试验最大蛋白浓度处较未酶解的EWP均增大了约一倍。

关键词：蛋清蛋白；酶解物；碱性蛋白酶；抗氧化性质

文章篇号：1673-9078(2011)12-1446-1450

Antioxidant Properties of Chicken Egg White Protein Hydrolysates

YANG Jin, TANG Chuan-he

(College of Light Industry & Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: The antioxidant properties of the hydrolysates, obtained by hydrolysis with Alcalase from chick egg white proteins (EWP) at degree of hydrolysis (DH) of 5%-15 % were characterized. The tested properties, including DPPH and hydroxyl radical scavenging abilities, as well as reducing power, and protein solubility (PS), surface hydrophobicity (H o) and free sulphydryl group content were also evaluated. These hydrolysates exhibited much lower H o and total free SH content. The hydrolysis greatly decreased the DPPH radical scavenging ability about 50% at the highest concentration of 1.0 mg/mL. In addition, the hydrolysis significantly increased hydroxyl radical scavenging ability and reducing power about 15% at their highest concentration.

Key words: egg white proteins (EWP); hydrolysate; Alcalase; antioxidant property

鸡蛋清蛋白含有人体所必需的多种氨基酸,且氨基酸组成配比均衡性好,是机体利用率最高的一种蛋白质[1]。目前鸡蛋清蛋白是食品工业中重要的成分配料，具备多种功能性质如起泡性、乳化性、凝胶性等，是食物中最优质的蛋白质之一[2]。

为了开拓蛋品资源加工新途径，提高蛋品的高附加值，酶解改善蛋清蛋白性质将是一个很好的研究方向。资料表明，蛋清白蛋白经蛋白酶适度水解，生成多肽的混合物，通过控制其水解度，可提高蛋白的收率，生成的多肽混合物也更有利于人体吸收[1]。同时蛋清蛋白经过蛋白酶水解后，其分子量降低，蛋白质的功能特性得以改善，溶解性提高，粘性、热凝固性降低，蛋白质的致敏性降低，使其更易于消化，并能产生抗氧化、降血脂、降血压等生理活性的小分子肽[3,4]。

本文通过Alcalase酶解鸡蛋清蛋白制备不同水解度的水解物，重点研究酶解后蛋清蛋白的抗氧化活性收稿日期：2011-08-02

作者简介：杨瑾（1987-），女，硕士研究生

通讯作者：唐传核，副教授 及相关物化性质，对提高蛋清的综合利用价值以及人类的健康具有十分重要的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

鸡蛋清蛋白，冷冻干燥制取；Alcalase酶制剂，诺维信公司；DPPH，Sigma公司；Ferrozine，ULTRA 上海生工生物技术服务有限公司；FeCl2·4H2O，天津科密欧化学试剂有限公司；铁氰化钾，天津科密欧化学试剂有限公司；NaOH，天津科密欧化学试剂有限公司；Tris，北京鼎国生物技术有限公司；三氯乙酸，广州化学试剂厂；CR22G高速冷冻离心机，日本日立公司；高效液相色谱仪Waters1525，美国Waters公司；荧光分光光度计F-7000，日本日立公司；紫外-可见分光光度计2501PC，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水解产物的制备

鸡蛋清蛋白溶于去离子水配制3%（m/V）蛋白溶液，在沸水浴30 min后，迅速冷却至最佳温度55 ℃，于55 ℃水浴中保温10 min，调pH至8.0，加入Alcalase

DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.12.019

酶（底物蛋白与酶的比例为100:2，m/V）后于55 ℃摇床反应，酶解过程中，每隔30 min通过滴加0.5 M NaOH使反应体系的pH值保持在8.0，并记录消耗的NaOH体积。并于水解度为5%，10%，15%时，取样于90 ℃水浴灭酶10 min，在冰水中迅速冷却后调pH 值7.0并离心（4000 g，20 min，20 ℃），上清液冻干既得5%，10%，15%的三种酶解产物。

1.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

根据Laemmli[5]的方法，在不连续缓冲液系统上进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶和浓缩胶质量分数分别为15%和5%。用SDS-PAGE样品缓冲液（含质量分数为5%的β-巯基乙醇和10%的SDS）配制4%样品溶液（2 mg蛋白样品/0.5 mL缓冲液），充分震荡混合均匀，电泳前沸水加热处理5 min，离心（8000 g，5 min），进样量5 μL。凝胶电泳于恒定电流下进行，在浓缩胶处电流保持40 mA，分离胶处增至80 mA。凝胶染色及脱色后，于凝胶成像系统进行成像处理。

1.2.3 高效体积排阻色谱（HPSEC）分析

采用Waters高效凝胶液相色谱（HPLC）系统：Waters 1525泵，检测器为 Waters 2487双波长紫外吸收检测器，高效凝胶柱为TSK-GELG2000SWXL （0.78 × 30 cm, Tokyo, Japan）柱，保护柱为Protein-PakTM 125 (0.6 × 4 cm, Tokyo, Japan）。待测样浓度1%（m/V），以含50 mM NaCl的磷酸缓冲液（50 mM PBS, pH 7.2）配制，于10000 g离心10 min，取上清液过膜（0.45 μm）分析。凝胶柱用洗脱剂（磷酸缓冲液）平衡后即可上样，流速为0.75 mL/min，进样量10 μL，于280 nm波长下检测并记录洗脱峰，数据分析采用Breeze软件（Waters, Division of Millipore, Milford, MA, USA）。

1.2.4 表面疏水性（Ho）

Ho测定参考Haskard等[6]的方法。用0.01 M磷酸缓冲液配制1.5%（m/V）蛋白原液，并配制8.0 mM ANS-（荧光探针）溶液。测定前，取4 mL磷酸缓冲液，加入10，20，30，40，50 μL的1.5%的蛋白原液，在测试前添加20 μL of ANS-溶液，充分震荡后立即于F4500荧光光谱仪测定荧光强度（Hitachi Co., Japan），激发波长390 nm，发射波长470 nm，激发和发射夹缝宽均为5 mm。以最大荧光强度为纵坐标，蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，通过线性回归分析得到的斜率即为Ho。

1.2.5 暴露巯基和总巯基含量测定

巯基含量测定采用经Beveridge改进后的Ellman[7]法，稍作改动。Ellman,s试剂的配制将4 mg的DTNB 溶入1 mL的Tris-glycine缓冲溶液（0.086 M Tris，0.09 M glycine，0.04 M EDTA，pH 8.0）。其中总巯基的测定将15 mg蛋白溶入5.0 mL的加入尿素浓度为8 mM的Tris-glycine溶液中，而游离巯基含量的测定即将15 mg蛋白加入不含尿素的5.0 mLTris-glycine溶液中。然后加入50 mL的Ellman,s试剂，混合液在25o C 的室温中静置1 h，在10,000g下离心10 min。取上清液于412 nm比色，以缓冲溶液作为空白。游离巯基含量可用以下公式计算：

SH (μM/g)=(73.53×A412×D)/C

注：其中D为稀释常数，C为蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.6 还原力

还原力的测定参考Oyaizu等[8]建立的方法：10 mL不同浓度梯度的样品溶液（0~5 mg/mL），加入2.5 mL 0.2 M磷酸缓冲液（pH 6.6）、2.5 mL浓度为1 %的K3（CN）6，于50℃的水浴锅中反应20 min，迅速冷却，加入2.5 mL 10 %（m/V）的TCA溶液，离心（3000 g，10 min，20 ℃）后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 去离子水和0.5 mL浓度为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀后静置10 min，于700 nm处测定吸光值，吸光值越大，说明样品的还原力越强。

1.2.7 羟自由基清除能力

羟自由基清除能力的测定方法参考Avellar[9]的方法，具体如下：用50 mM磷酸缓冲液配制含有0.75 mM 邻二氮杂菲（1,10-phenanthroline）和0.75 mM FeSO4的溶液（pH 7.4），用其配制不同浓度梯度的样品溶液（0~1.0 mg/mL）4 mL，分别加入2 μL双氧水（30%，m/V），37 ℃水浴中反应60 min后，于536 nm波长下测定吸光度值。清除能力由公式（2）计算，式中，A S为样品的吸光度值；A1为对照样吸光值（含邻二氮杂菲、FeSO4和H2O2，但不含样品）；A0为空白样的吸光度值（仅含邻二氮杂菲和FeSO4）。

OH自由基清除力(%)= [(A S-A1)/(A0-A1)]×100

1.2.8 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的测定参考Shimada等[10]的方法：配制浓度为1 mg/mL蛋白贮液，稀释成浓度为0、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/mL的样品溶液各2 mL，加入0.2 mmol/mL的DPPH乙醇溶液（现配）2 ml，振荡摇匀，在室温下放置30 min后，以无水乙醇为空白，于517 nm处测定吸光值，计算公式见式（3），式中，A S为样品溶液对应吸光度值；A b为蒸馏水（0 mg/mL）对应吸光值。

DPPH清除率(%)=[1-(AS/Ab)]×100

吸光值越小，代表其清除DPPH能力越强。

2 结果与分析

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