第七章基因芯片技术.

芯片实验室的特点:
其一、集成性。目前一个重要的趋势是：集成的单元部件越来越多，且集成 的规模也越来越大。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、 膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀（包括主动阀和被动阀），微泵 （包括机械泵和非机械泵）；微混合器，微反应器，另外还有微通道和微检 测器等。
基因功能分析研究
将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在 一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周 期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包 括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的 mRNA或逆转录 所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特 异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进 行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。
其二、分析速度极快。Mathies研究小组在一个半径仅为8厘米长的园盘上集成 了384个通道的电泳芯片。他们在325秒内检测了384份与血色病连锁的H63D 突 变株（在人HFE基因上）样品，每个样品分析时间不到一秒钟。 其三、高通量。 其四、能耗低，物耗少，污染小。每个分析样品所消耗的试剂仅几微 升至几十个微升，被分析的物质的体积只需纳升级或皮升级。 其五、廉价，安全。无论是化学反应芯片还是分析芯片由于上述特点随着技术 上的成熟，其价格将会越来越廉价。针对化学反应芯片而言，由于化学反应在 微小的空间中进行，反应体积小，分子数量少，反应产热少，又因反应空间体 表面积大，传质和传热的过程很快，所以比常规化学反应更安全。
图象分析系统
高密度微点阵分析软件
4.4 生物芯片的软件系统与数据处理
当从芯片发出的荧光转换成数字输 出后，数据文件就被定量和翻译，通过 重叠芯片像线栅，软件对芯片上的每个 点计算平均密度值，从而完成定量，通 过对芯片上实验点和对照点的比较，选 出杂交点，并定量。
一个完整的生物芯片配套软件应 该包括生物芯片扫描仪的硬件控制软 件、生物芯片的图像处理软件和数据 提取或统计分析软件，以及芯片表达 基因的国际互联网上检索和表达基因 数据库分析和积累。
2202芯片点样仪
• 生产商 Bio-Rad • 性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴) ， 重复性：3um 球面精确性：l0um。 一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量>82,000个点
（2）喷墨法（通过压电晶体或其他推进 式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻 璃载体上。）
• 基因芯片——又称DNA芯片或DNA阵列， 是生物芯片的一种类型，它是将DNA分子 固定于支持物上，并与标记的样品杂交， 通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判 断样品中靶分子的数量，进而得知样品中 mRNA 的表达量，也可以进行基因突变体 的检测和基因序列的测定。
1.2 基因芯片分析流程
基因芯片分析的过程主要包括样品及其标记 处理、芯片制作、分子杂交、信号的检测和数据 处理及分析等几个步骤。 • 基因芯片的理论基础： • 传统的Southern blot和Northern blot是将受检测 的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针 来检测样本中是否存在互补的DNA序列。 • 基因芯片的核心原理与Southern blot和Northern blot相同，只是相反将各种探针固化到基质上， 用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质 的变化。
速定位在硅基质、导电玻璃上。）
2.3 按芯片固定的生物分子类型分类 （1）基因芯片或DNA芯片 （2）蛋白质芯片 （3）芯片实验室（lab-on-chip）
将一个实验的各个步骤微缩于一个芯片上
芯片实验室（Lab-on-a-chip）或称微全分析系统 （Miniaturized Total Analysis System,µ -TAS）是指把生物 和化学等领域中所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离检 测等基本操作单位集成或基本集成一块几平方厘米的芯片上， 用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的 一种技术。
第五节
基因芯片的应用
1、基因表达分析 2、基因型及多态性分析 3、杂交测序 4、核酸和蛋白质相互作用的研究 5、疾病的诊断与治疗 6、药物开发 7、在营养与食品卫生领域的应用 8、在环境科学领域中的应用
基因芯片在医学领域的应用
一、基因芯片可应用于疾病诊断 1）肿瘤的基因诊断 例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列 和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53 基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。 2）用于诊断遗传性疾病 例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫 血的检测芯片
第七章
生物芯片技术
•
生物芯片是八十年代末在生命科学 领域中迅速发展起来的一项高新技术， 它主要是指通过微加工技术和微电子 技术在固体芯片表面构建的微型生物 化学分析系统，以实现对细胞、蛋白 质、DNA以及其他生物组分的准确、快 速、大信息量的检测。
Fra Baidu bibliotek
世界著名商业杂志《财富》对基因
生物芯片领域非常看好，它在其1997年
1
2 3 4 5 6
通过光刻掩膜曝光
去保护区域被激活 固相化合成1个碱基 通过另一个光刻掩膜曝光 引入另一个碱基 重复这一步骤
2、预合成后点样
（1）接触点样法（将样品直接点在基体 上） 优点：仪器结构简单、容易研制，是 一种快速、经济、多功能的仪器。 缺点：每个样品都必须是合成好、经 过纯化、事先保存的。
2.4 按芯片使用功能分类 （1）测序芯片 （2）表达谱芯片 （3）基因差异表达分析芯片
一组寡核苷酸探针
TACGTTAG
ATACGTTA
由杂交位置确定的一组 核酸探针序列
ATACGTTA TACGTTAG ACGTTAGA CGTTAGAT
杂交探针组
GTTAGATC
ACGTTAGA
CGTTAGAT GTTAGATC
1、原位合成
光刻DNA合成法（将半导体工业中的光刻技术
和DNA化学合成相结合，把光不稳定保护基团保 护的4种DNA模块固定在玻片上，通过光脱保护， 用少量的保护寡核苷酸和试剂按照设计的序列进 行DNA合成。）
优点：合成的密度和精度优于后两种方法。 缺点：需要花费大量的时间去设计和制造 价格很高的照相掩蔽网。
ATACGTTAGATC
重组的互补序列
—TATGCAATCTAG TATGCAATCTAG
靶序列
测序芯片
基因表达谱芯片
基 因 差 异 表 达 分 析 芯 片
第三节
基因芯片的制作
固相介质 硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。 靶片段 DNA、寡核苷酸、RNA等。 探 针 mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。 标记物 常采用荧光剂（如Cy3、Cy5）；同位素等。
3.1 用于芯片制作的DNA样品的来源
（1）从细胞或组织中提取mRNA 后反转录成 cDNA 文库，经测序及生物信息学分析得到代表 各个基因的DNA序列，用PCR 扩增技术或DNA 固相结合技术来获取人们所期望的各种基因片段；
（2）利用基因组测序数据，经生物信息学分析 得到代表各个基因的数据，在利用PCR 技术或 DNA 固相结合技术来获取人们所期望的各种基因 片段。
的 3 月 31 刊中讲到：“微处理器使我们
的经济发生了根本改变、给人类带来了
巨大的财富、改变了我们的生活方式。
然而，生物芯片给人类带来的影响可能
会更大…...”
酵 母 全 基 因 组 基 因 芯 片
第一节
生物芯片简介
1.1 生物芯片的定义 生物芯片是指通过机器人自动印迹或光引 导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙 膜上制造的生物分子微阵列，根据分子间的 特异性相互作用的原理，将生命科学领域中 不连续的分析过程集成于芯片表面，以实现 对细胞、蛋白 质、基因及其他生物组分 的准确、快速、大信息量 的检测。
3.2 生物芯片的制作方法
生物芯片微阵列的制作技术按照制作方 法可分为：原位合成和预合成后点样。 原位合成法是由点样系统将探针的组成 部分逐步转移到基体上，同时实现探针合成 和转移的目的。 预合成后点样是指制备芯片微阵列前， 要固定的探针已经合成好，点样系统需要做 的就是把这些合成好的样品涂印或喷涂在基 体上。
该法所需的样品都必须是合成好的 纯样品（cDNA、染色体DNA和抗体）。 与接触点样法不同之处在于喷嘴不 与芯片接触。
点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库， 然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液， 逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点, 并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。
2、基因芯片的缺点
基因芯片技术体系的建立和使用需要较 大的投入。 （但是，相对于传统的表达分析技术而 言，单个基因分析的成本仍是较低的。）
第二节
生物芯片的分类
2.1 按载体材料分类 玻璃芯片 硅芯片 陶瓷芯片 玻璃芯片具有易得、荧光背景低、应 用方便等优点，目前在国际上广泛使用。
2.2 按点样方式分类 1、原位合成芯片（将半导体中的光蚀刻技术运
与经典分子杂交的区别：
1. 杂交时间短，30分钟内完成 2. 可同时平行检测许多基因序列
影响杂交反应的因素：
靶分子浓度、探针浓度、靶分子和探 针的序列组成、盐浓度及杂交温度和时间 等。
4.3 芯片结果读取与扫描仪
生物芯片的扫读（扫描）是指将与目的DNA （或RNA）杂交后、或与目的抗原、抗体、 或受体等目的靶分子反应结合后的生物芯片 上成千上万个点阵的生物反应结果阅读出来， 转变成为可供计算机处理的数据。 荧光标记的生物芯片扫描仪按其原理与结构 可以分为激光系统扫描仪和CCD系统扫描仪。
第四节
基因芯片的杂交及结果分 析
4.1 探针的标记 标记的方法通常是在反转录的底物中加 入带有标记基团的寡核苷酸单体，通过反 转录将标记分子渗入cDNA 分子中。
mRNA反转录标记方法直接影响DNA芯 片分析结果的准确性及重现性。
4.2 杂交 在一定条件下，分子间氢键的断裂 与恢复是 DNA/DNA、DNA/RNA 分子 间选择性结合的根本动力，这一过程 称之为杂交。
玻璃基质
基因芯片 微 点 阵
制备系统
3.3 DNA分子在刚性表面的固定 制作生物芯片的载体材料必须符合下列要 求： （1）载体表面必须适应透射或反射光的 测量； （2）使单位载体上结合的生物分子达到 最佳容量； （3）载体应当是惰性的和有足够的稳定 性。
• 基因芯片制作的关键就是如何将大量的探 针分子固定于支持物上，并保持探针分子 的构像处于自然状态，使探针 DNA 分子能 自由地与样品分子进行杂交。
• 基因芯片杂交结果要用专用的扫描系统 读取。
D A B C 数模转 换器 B E 放大器
计算机
A:激光器 B:滤光片 C:二色镜 D:反光镜 E:关栅
基因芯片扫描结果
不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记 的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫
高密度微点阵检测扫描系统
基因芯片荧光侦测仪
用到DNA合成化学中，以单核苷酸或其他分子大 分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）
2、微矩阵芯片（目前应用最广泛的基因芯片之一。
具有高密度、制作简便的特点。其是将用PCR或 化学合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用针 点或喷点的方法直接排列到玻片等载体上，从而 制备成芯片。）
3、电定位芯片（利用静电吸附的原理将DNA快
1 样品制备
2 DNA提取
3 荧光标记
4 分子杂交
5 信号检测 6 点阵分析
1.3 基因芯片技术的特点
1、基因芯片的优点
1）高通量性：可同时并行分析成千上万种分子。 节省时间，并减少系统误差。 2）微型化 3）高度自动化 4）结果重现性和准确性更高（基因芯片能在同 一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂 交分析，这样就实现了平行化操作，避免了各 种误差，使实验结果具有可比性）
3）用于病原体的检出和确定 例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断 芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原 体。 二、用于组织配型 例：上海复旦长江生物医药股份有限公司开 发了HLA分型芯片，目前已在国内各大血站 投入应用。 三、药物研究
检测与疾病相关的基因,
进而用于疾病诊断 目前主要涉及： 癌症、 心血管疾病、 血液病、 遗传性疾病、 神经系统疾病、 部分感染性疾病、 免疫反应相关性疾病 毒物引起的损伤等。