TaNHX_2基因植物表达载体的构建及在拟南芥中的功能分析

西北植物学报,2006,26(11):2250-2256

Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin.

文章编号:100024025(2006)1122250207

Ta N H X2基因植物表达载体的构建

及在拟南芥中的功能分析

俞嘉宁1,原江锋2,杨建雄23,赵咏梅3,王喆之2,张志琪2 (1陕西师范大学生命科学学院,西安710062;2陕西师范大学药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室,西安710062;

3西安文理学院生命科学系,西安710065)

摘　要:将TaN H X2基因重组于质粒pBIN438的CaMV35S启动子下游,构建含TaN H X2基因的植物双元表达载体pBIN4382TaN H X2。采用根癌农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子。经含Kan的平板筛选及PCR鉴定,获得54株阳性植株,选取生长一致的转基因阳性植株进行耐盐、耐旱分析,结果表明TaN H X2能够提高转基因植株的耐盐性和耐旱性。

关键词:T aN H X2;载体构建;拟南芥;基因表达;耐逆性

中图分类号:Q789文献标识码:A

Construction of Phyto2expression V ector and Functions in

Ar abidopsis t halia na of TaN H X2G ene

YU Jia2ning1,YUAN Jiang2feng2,YAN G Jian2xiong23,ZHAO Y ong2mei3,

WAN G Zhe2zhi2,ZHAN G Zhi2qi2

(1College of Life Science,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China;2Key Laboratory of Medicinal Plant Resources and

Nature Pharmaceutical Chemistry(Ministry of Education),Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China;3Depart ment of

Life Sciences,Xi’an University of Art s and Science,Xi’an710065,China)

Abstract:T a N H X2was recombined to t he downst ream of CaMV35S p romotor in plasmid pB IN438to form binary p hyto2exp ression vector pBIN4382T aN H X2.pB IN4382T aN H X2was transformed into A rabi dopsis t hali ana by A g robacteri um t umef aciens2mediated vacuum filt ration and t hen T0t ransgenic seeds of A rabi2 dopsis t hali ana were obtained.54po sitive plant s were obtained by kanamycin plate screening and PCR i2 dentificatio n and uniformly2growing ones of t he plant s were taken to st udy t heir salt and drought tolerances and T aN H X2was fo und to be capable of increasing t he salt and drought tolerances of t he transgenic plant s.

K ey w ords:T aN H X2;vector co nstruction;A rabi dopsis t hali ana;gene expression;tolerance

植物在生长发育中时常要受到不良环境的胁迫,如盐渍、干旱、低温等。其中盐胁迫严重影响植物的生长。为了减少盐胁迫造成的伤害,植物在长期进化过程中形成了一套耐盐机制,或增加Na+的外排,或限制Na+的吸收,或将Na+束缚在液泡中。目前已经知道有些植物主要通过液泡膜Na+/H+反向运转蛋白将Na+隔离在液泡中以减少Na+的毒害。因此液泡膜Na+/H+反向运转蛋白在植物耐

收稿日期:2006204210;修改稿收到日期:2006210216

基金项目:国家转基因植物研究与产业化开发专项(J20022B2001);2004年陕西师范大学重点基金作者简介:俞嘉宁(1969-),女(汉族),副教授,博士。

3通讯联系人。Correspondence to:YAN G Jian2xiong.E2mail:jxyang@

盐性方面具有重要作用[1]。在耕地有限,人口不断增长的今天,培育具有较高耐盐能力的植物品种已成为植物分子育种工程的目标之一。

目前认为,Na+进入液泡主要通过液泡膜上的Na+/H+反向运转蛋白来完成,一方面减少了Na+对细胞质造成的毒害,同时又可利用Na+作为渗调剂来吸收水分[2]。Na+/H+反向运转蛋白吸收Na+依靠液泡膜上H+2A TPase及H+2PPiase产生的质子梯度作为驱动力来完成[3]。1985年,Blum2 wald[4]首次在甜菜组织中发现Na+/H+反向运转蛋白,此后在多种盐生植物及耐盐的淡土植物中也发现了Na+/H+反向运转蛋白活性[5～7]。

俞嘉宁等[8]从小麦中获得一个液泡膜Na+/H+反向运转蛋白基因T aN H X2,其开放阅读框(ORF)是1614bp,编码1个含538个氨基酸,分子量为59.7kD的蛋白质。通过SMAR T分析,该蛋白具有10个跨膜区和38个氨基酸的膜定位信号,与小麦中已获得的T a N H X1和水稻、拟南芥来源的N H X基因进行氨基酸同源性比较,发现跨膜区的氨基酸序列十分保守,利用酵母模式系统做了功能互补实验及过量表达实验,证明T aN H X2可有效提高酵母的耐逆性。

本实验在上述实验基础上构建含T a N H X2基因的表达载体,利用农杆菌介导的真空渗透法转到拟南芥中,利用转基因植株进一步研究T aN H X2基因对拟南芥耐盐性和耐旱性的影响,为进一步通过转基因方法有效提高农作物及其它植物的抗逆性研究提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　植物材料

野生型拟南芥(A rabi dopsis t hali ana,Colum2 bia ecotype)(由中国科学院遗传研究所提供),将拟南芥种子播种于盛满培养土的直径为7cm的小花盆中,用1/3MS0培养液将培养土浇透,放到22℃、光照强度3000～4000L x、相对湿度为70%的培养室培养。待拟南芥开始抽苔时,切掉主苔,待侧枝伸出2～10cm时,将其授粉花及荚果除去进行转化。

1.2　TaN H X2基因表达载体构建

本试验用的植物表达载体pB IN438(由中国科学院遗传研究所803组陈受宜研究员惠赠),含有CaMV35S启动子和新霉素磷酸转移酶(N P TⅡ)基因,可赋予被转化植物细胞以卡那霉素抗性。

将连接于p GM2T easy载体中的T aN H X2全长基因,用PCR法扩增出含B am HⅠ和K p nⅠ的片段,设计引物Ⅰ:5′端引物为5′2GGC GGA TCC (B am HⅠ片断)GGA GGCCACCA T GGGT TAC2 CAA GT GGT GGCGGC GCA G;3′端引物为5′2 GGC GGTACC(K p nⅠ片断)TCA T TCCAC GA G2 TAC GT TC GGA TCGG23′(由北京奥科生物有限公司合成)。PCR扩增反应体系25μL,其中15ng DNA,10×缓冲液2.5μL,10mmol/L dN TP各为0.5μL,20μmol/L引物各1μL,T aq DNA聚合酶(Ta KaRa公司)1μL。扩增条件为94℃预变性5 min,94℃30s,56℃40s,72℃2min30s,共30个循环;72℃10min,4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收1614bp片段,经B am HⅠ/K p nⅠ双酶切后连接于同样用B am HⅠ/K p nⅠ双酶切的表达载体pB IN438中,形成了含有T aN H X2全长cD2 NA的pB IN4382T aN H X2。重组质粒转化 E.coli D H5α,经PCR验证,B am HⅠ和K p nⅠ双酶切鉴定后由上海基康生物公司测序。

1.3　转基因植株的获得及初步筛选

在转化前1d,挑取含pB IN4382T aN H X2质粒的农杆菌GV3101接种于5mL LB培养基(50mg/ L利福平,50mg/L卡那霉素)中,28℃、200r/min 培养至菌液OD600在1.8～2.0之间时,以1∶100比例转接到100mL LB培养基中,5000r/min离心15min,收菌,将菌体重悬于转化液(2.2g MS,5%蔗糖,1×B5Vitamins,0.044mol/L62BA,50μL/L Silwet L277,用0.4mol/L NaO H调p H至5.8)中。将待转化的拟南芥连同花盆倒浸于含pB IN4382T aN H X2质粒转化液的烧杯中,使莲座叶以上的部分浸没于转化液中,抽真空,维持0.05 M Pa压力5min。取出植株,避光侧放24h后,置于22℃,光照强度3000～4000L x培养室中培养3～4周,收取T0代种子。

将收获的T0代种子用清水漂洗,除去灰尘、杂质,然后经75%酒精漂洗5min、15%漂白剂10 min、无菌水冲洗3～5遍后,平铺于含50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS选择培养基中,每皿约200粒种子,22℃培养。10d后将具有卡那霉素抗性的绿色幼苗移到含不同浓度PEG6000和NaCl的MS培养基中或盛满培养土的直径7cm的塑料小盆中继续培养,以待进一步检测和抗性分析。

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11期 俞嘉宁,等:TaN H X2基因植物表达载体的构建及在拟南芥中的功能分析