番茄抗叶霉病基因Cf-10的精细定位及抗病应答机制分析

番茄抗叶霉病基因Cf-10的精细定位及抗病应答机制分析
番茄（Solanum lycoperslcum）是世界范围内种植的蔬菜作物,在人们日常生活中扮演了重要的角色。

根据联合国粮农组织（FAO）统计,2012年番茄的产量为16.2亿吨,这将带来550亿美元的净利润。

而番茄叶霉病是由番茄叶霉菌（Cladosporium fulvum）引起的番茄重要病害之一,该病害通常可使番茄产量减少20³0%,严重时可达到50%。

因此,找到番茄叶霉病的抗病基因,进行分子改良育种,显得尤为重要。

目前已克隆的番茄抗叶霉病基因有Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9,Cf-9DC等,这其中Cf-4、Cf-9等抗病基因已经应用到实际的育种生产中。

但是叶霉菌具有生理小种多、分化速度快等特点,田间一些含有抗病基因的品种被新产生的生理小种所克服,因此我们现在急需挖掘新的抗病基因来对抗新的生理小种,增加番茄产量,减少经济损失。

番茄与叶霉菌的互作是研究植物与病原菌互作的模式,同时符合基因对基因假说。

抗病品种中的抗病基因与病原菌中的生理小种互作的关键是,Cf基因编码的类受体蛋白能够特异性识别病原菌中无毒基因编码的效应因子,从而发生过敏性坏死反应（Hypersensitive Response）。

随着HR的发生,植物体内的保护酶系和活性氧含量都发生变化,从而进一步激发抗病机制下游的防御反应。

挖掘新的抗病基因,并通过分子生物学的一些手段,把抗病基因应用于新品种选育中,对番茄的抗病育种有着重要的作用。

经过长期的田间调查和性状鉴定,含有番茄抗叶霉病基因Cf-10的抗病材料Ontario 792,对多数的生理小种表现出有效抗性。

Cf-10基因最初被Kanwar在1980年运用经典遗传学的分析方法定位在8号染色体的长臂上,而后的研究较少,
影响了Cf-10基因在育种中的应用。

本研究以番茄抗叶霉病基因Cf-10的抗生理小种范围、抗性遗传规律、Cf-10基因与叶霉菌的非亲和互作过程分析、Cf-10基因的定位和Cf-10介导的抗病应答机制为研究重点,对Cf-10基因进行全面分析,为以后Cf-10基因的克隆以及全面揭示Cf基因抗病机理提供理论基础。

本研究的主要研究结果如下:（1）通过人工接菌鉴定确定番茄抗叶霉病基因Cf-10的抗性范围,调查结果显示含有
Cf-10基因的抗病材料Ontario 792对生理小种1.2.3.4.5和生理小种1.2.3.4.9表现出抗病性,结合先前研究基础,该材料共对8个生理小种表现抗病,2个生理小种表现为免疫。

（2）通过对抗、感亲本接种叶霉菌生理小种1.2.3.4后,比较非亲和互作与亲和互作的异同。

通过锥虫蓝染色和电镜观察发现非亲和互作（抗病）中有过敏性坏死产生,且抗病品种内菌丝的生长受到限制;而亲和互作（感病）中,无明显坏死斑产生且菌丝繁殖较快;接种病原菌后,抗感亲本内的保护酶（SOD、POD、CAT）活性与活性氧ROS含量都呈上升趋势,但CAT与POD的活性在抗病亲本Ontario 792中始终高于感病亲本Money Maker。

运用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）测定互作过程中水杨酸SA和茉莉酸JA 含量变化,在抗病品种Ontario792中发现JA的含量在接菌后第9 d达到峰值,而JA含量在感病亲本Money Maker中变化幅度较小。

（3）通过对抗感亲本构建的F₂代群体进行接种鉴定,统计结果表明抗病亲本及F₁代全部抗病,感病亲本全部表现为感病,F₂代群体分离比符合孟德尔遗传规律3:1,回交群体BC₁P₂的抗感比符合1:1,再次确认抗叶霉病基因Cf-10的遗传规律为单基因显性遗传。

（4）通过亲本及抗、感池的重测序分析,将Cf-10基因定位于1号染色体短臂上3.29 Mb区间内,候选区间内的SNP位点的非同义突变有204个、Indel的
移码突变有23个。

根据已克隆的番茄叶霉病基因编码蛋白的典型结构特征即eLRR-TM结构,结合候选区间内全部基因的功能注释,在候选区间内得到16个（Solyc01g005720.3、Solyc01g005715.1、Solyc01g005865.1、Solyc01g005760.3、Solyc01g005710.2、Solyc01g007130.3、Solyc01g008140.3、Solyc01g005730.3、Solyc01g008390.2、Solyc01g006545.1、Solyc01g008410.2、Solyc01g006550.3、Solyc01g005775.1、Solyc01g005870.2、Solyc01g005755.1、Solyc01g008800.2）与已克隆的抗叶霉病基因结构相似的基因作为候选基因,其中包含非同义突变和移码突变基因9个（Solyc01g005730.3、Solyc01g008390.2、Solyc01g006545.1、Solyc01g008410.2、Solyc01g006550.3、Solyc01g005775.1、Solyc01g005870.2、Solyc01g005755.1、Solyc01g008800.2）。

（5）利用KASP标记,根据候选区间内CDS区的SNP的非同义突变和Indel
的移码突变设计16对KASP引物,其中有5对将F₂代群体有效分型,并成功缩小候选区间在番茄1号染色体1224466²014004之间,约
790kb内。

同样根据Cf基因编码蛋白的特殊结构在该区间内筛选候选基因,筛选到1个候选基因Solyc01g007130。

（6）对抗病材料Ontario 792和感病材料Money Maker接种叶霉菌生理小种1.2.3.4后进行转录组测序分析,在Cf-10基因调控的抗病反应过程中,共检测到2242个差异表达基因,其中1501个基因上调表达,741个基因下调表达。

大部分的差异表达基因和防御信号转导途径相关,主要包括植物-病原菌互作、氧化还原过程及植物激素传导。

这些差异表达基因中包含192个转录因子,这些转录因子分布于42个家族中。

在对转录组数据进行qRT-PCR验证时,Solyc12g094620基因在与植物保护酶相关的信号转导通路（ko04146）上,Solyc12g094620在数据库中注释与CAT合成相关,同时该基因转录组测序结果的表达量上调,这与之前CAT活性的测定结果相
一致。

（7）将Cf-10基因与Cf-12基因调控的抗病反应的转录组数据比较,有1193个差异表达基因完全一致。