辣根过氧化物酶PPT课件
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第三节 酶标记物的制备
一、酶制剂及其底物
作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
(1) 活性高 (2) 性质稳定 (3) 专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感，重复性好，简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶， β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
2、HRP标记多抗
1. 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。 2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅
拌20分钟。 3. 将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液
透析，4℃过夜。 4. 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的pH
底物
产物性质
主要吸收峰波长（nm）
ABTS
绿色水溶性产物
410、650
OPD
桔黄色水溶性产物
492
邻苯二胺
TMB 四甲基联苯胺
蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸，产生黄色
370、652 450
DAB
不溶性棕色沉淀
3.3－二氨基联苯胺
免疫组化
Chloronaphthol 产物颜色介于蓝色-蓝紫色，易于成像 免疫印迹、免疫组化
NBT
黄色产物----硝基酚 不溶性黑紫色沉淀
405nm 免疫印迹
其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶
作为酶标记对象的抗原与抗体要求：
抗原要求纯度高，抗原性完整
抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比 活性较高，能批量生产，易纯化。
制备方法要求：
（1）技术方法简单、产率高，重复性好； （2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性； （3）酶标记物稳定 ，不形成聚合物。
酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液中
1～5% 5～25%
双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中巯 高 基将两者偶联起来
异双功能基团交联剂HECCM分别通过其羟 85% 琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体/ 抗原上游离氨基和巯基结合
（一）过碘酸盐氧化法
原理：是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位 -0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白 中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后， 再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG 偶联物。
AP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、 β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP 标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋 白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
AP常用底物
底物
产物性质
主要吸收峰波长（nm）
pNPP 对-硝基苯磷酸酯
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用 得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外 ，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基 苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，灵敏度和稳定性均好。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶 促反应中使用的H2O2不能过量。
HRP常用底物
AEC
棕红色沉淀，容易成像
多重染色的第二标记
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP) ，
AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水 解酶，由多个同功酶组成。
小牛肠粘膜AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6； 大肠杆菌AP分子量为80kDa，最适pH为8.0。
10、将交联物过Sephdex G200（2.6×100cm）层析纯化，
分管收集第一峰。
Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm×100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min.
二、酶结合物的制备方法
方法
直接 过碘酸盐 结合 氧化法 法
戊二醛 一步法
交 戊二醛 联 二步法 法
苯二马来 酰亚胺法
异双功能 基团交联 法
原理
酶标记率
过碘酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基，70% 与抗体/抗原中游离反应，形成Schiffs碱。
酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中，戊 二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨基反 应，生成Schiffs碱
所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和IgG 结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前最常用的方法。
1、HRP标记腹水单抗
过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗
1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中； 2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h； 3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀； 4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀； 5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h； 6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器 外筒中； 7、用少许PBS将交联物全部洗出； 8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀 ，室温作用30min； 9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)
HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。 HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和
棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。 HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,
酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm
，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。 高纯度的酶RZ值应在Leabharlann Baidu.0左右(最高可达3.4)。
HRP酶促反应
酶促反应的过程： HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
一、酶制剂及其底物
作为标记抗体用的酶应满足下列要求：
(1) 活性高 (2) 性质稳定 (3) 专一性强 (4) 酶催化底物的显色信号易于判断和测量 (5) 方法敏感，重复性好，简单易行 (6) 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶， β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
2、HRP标记多抗
1. 称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中。 2. 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅
拌20分钟。 3. 将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液
透析，4℃过夜。 4. 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的pH
底物
产物性质
主要吸收峰波长（nm）
ABTS
绿色水溶性产物
410、650
OPD
桔黄色水溶性产物
492
邻苯二胺
TMB 四甲基联苯胺
蓝色水溶性产物 加入硫酸或磷酸，产生黄色
370、652 450
DAB
不溶性棕色沉淀
3.3－二氨基联苯胺
免疫组化
Chloronaphthol 产物颜色介于蓝色-蓝紫色，易于成像 免疫印迹、免疫组化
NBT
黄色产物----硝基酚 不溶性黑紫色沉淀
405nm 免疫印迹
其它：酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、碳酸苷酶、溶菌酶和脲酶
作为酶标记对象的抗原与抗体要求：
抗原要求纯度高，抗原性完整
抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比 活性较高，能批量生产，易纯化。
制备方法要求：
（1）技术方法简单、产率高，重复性好； （2）标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性； （3）酶标记物稳定 ，不形成聚合物。
酶和抗体/抗原先后分别加入戊二醛溶液中
1～5% 5～25%
双功能交联剂PDM通过酶和抗体/抗原中巯 高 基将两者偶联起来
异双功能基团交联剂HECCM分别通过其羟 85% 琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基与酶和抗体/ 抗原上游离氨基和巯基结合
（一）过碘酸盐氧化法
原理：是一种糖蛋白,糖链部分无活性，其己糖邻位 -0H可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，再与抗体蛋白 中游离-NH2形成schiff碱；酶与抗体结合反应后， 再加入硼氢化钠(NaHB4）还原成稳定的HRP-IgG 偶联物。
AP作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、 β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。
AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP 标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋 白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。
AP常用底物
底物
产物性质
主要吸收峰波长（nm）
pNPP 对-硝基苯磷酸酯
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。目前用 得较广泛和较满意的供氢体是：OPD和TMB。另外 ，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基 苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，灵敏度和稳定性均好。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶 促反应中使用的H2O2不能过量。
HRP常用底物
AEC
棕红色沉淀，容易成像
多重染色的第二标记
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP) ，
AP:系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水 解酶，由多个同功酶组成。
小牛肠粘膜AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6； 大肠杆菌AP分子量为80kDa，最适pH为8.0。
10、将交联物过Sephdex G200（2.6×100cm）层析纯化，
分管收集第一峰。
Fig 2-1. Gel filtration of the reaction mixture of HRP conjugated to mAb 13A4 on a Sephadex G200 column（2.6cm×100cm）, equilibrated with PBS, at a rate of 0.15 ml/min and a tube/15 min.
二、酶结合物的制备方法
方法
直接 过碘酸盐 结合 氧化法 法
戊二醛 一步法
交 戊二醛 联 二步法 法
苯二马来 酰亚胺法
异双功能 基团交联 法
原理
酶标记率
过碘酸盐钠氧化酶分子表面多糖羟基成醛基，70% 与抗体/抗原中游离反应，形成Schiffs碱。
酶和抗体/抗原同时加入戊二醛溶液中，戊 二醛两醛基分别与酶及抗体/抗原上氨基反 应，生成Schiffs碱
所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和IgG 结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前最常用的方法。
1、HRP标记腹水单抗
过碘酸钠氧化法，HRP直接标记腹水中的单抗
1、5mg HRP溶解于0.5ml 0.1M NaHCO3中； 2、加0.5ml10mM NaIO4，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h； 3、加0.75ml 0.1M Na2CO3，混匀； 4、加0.75ml 小鼠腹水单抗，混匀； 5、加Sephadex G25干粉0.5g，混匀，盖紧，室温作用3h； 6、用少许PBS将交联物转移于一支下口具玻璃棉的5ml注射器 外筒中； 7、用少许PBS将交联物全部洗出； 8、收集洗出液，加1/20V新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀 ，室温作用30min； 9、再加3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1h；
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)
HRP比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备。 HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，由无色的酶蛋白和
棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。 HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,
酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，PH5左右。 HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm
，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ表示酶的纯度。 高纯度的酶RZ值应在Leabharlann Baidu.0左右(最高可达3.4)。
HRP酶促反应
酶促反应的过程： HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O