柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展_刘亮

刘 亮 １， 戚向阳２， 董绪燕 ３
（ １． 武汉工业学院 食品科技学院， 湖北 武汉 ４３００２３； ２． 华中农业大学 食品科技学院， 湖北 武汉 ４３００７０； ３． 中国农业科学院 油料作物研究所， 湖北 武汉 ４３００６２）
摘要： 柠檬苦素类似物是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢物质。国外对柠檬苦素类似物的结构、性质、提
酮类物质的原因， 可能是由于柠檬苦素类似物缺少色 原 环 的 缘 故［１３］。Ｍｅｎｄｅｌ 等 人 （ １９９３ 年） 对 柠 檬 苦 素 类似物的结构进行研究时发现， 呋喃环和环氧结构是 草 地 黏 虫 的 幼 虫 拒 食 的 主 要 原 因 ［１４］。 Ｍｕｒｒａｙ 等 人 （ １９９９ 年） 报道， 柠檬苦素类似物糖甙没有昆虫拒食 作 用［１５］。 在 研 究 柠 檬 苦 素 类 似 物 对 豚 鼠 口 腔 癌 的 抑 制 作用时， Ｍｉｌｌｅｒ 等人发现添加葡萄糖和 Ｄ 环开环的柠 檬苦素或诺米林对癌症的化学抑制作用没有明显的改 善［１６］。
（ ｆ） Ｏｂａｃｕｎｏｎｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
（ ｇ） Ｎｏｍｉｌｉｎｉｃ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ
图 １ 图 １ 几种柠檬苦素类似物的结构
物糖甙在强酸和强碱条件下均发生水解， 生成相应的 甙元和葡萄糖。在 ０．５ Ｍ 的盐酸中， 温度 ７０ ℃下加 热 ５ ｈ， 柠檬苦素就会水解成柠檬苦素类似物甙元和 葡 萄 糖［６］。ｐＨ 值 为 ８ 时 ， 诺 米 林 甙 （ 见 图 １ （ ｅ） 所 示） 转化成奥巴叩酮甙 （ 见图 １ （ ｆ） 所示） ， ｐＨ 值为 ３ 时又转化为诺米林酸甙 （ 见图 １ （ ｇ） 所示） ［１１］。因 此 在 加 工 处 理 过 程 中 要 严 格 控 制 ｐＨ 值 和 温 度 等 因 素， 防止柠檬苦素结构的变化。
收稿日期： ２００７－ ０６－ ０１ 作者简介： 刘亮 （ １９７９－ ） ， 男， 山东人， 硕士， 研究方向： 天然产物化学。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｒｌｌ１９７９＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。
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农产品加工·学刊
２００７ 年第 ７ 期
（ ａ） Ｌｉｍｏｎｉｎ
（ ｂ） Ｌｉｍｏｎｏｉｃ ａｃｉｄ
（ ｃ） Ｄｅｏｘｙｌｉｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ
１９６５ 年 ， Ｄｒｅｙｅｒ 首 次 使 用 薄 层 色 谱 （ ＴＬＣ） 对 柠 檬 苦 素 类 似 物 甙 元 进 行 了 定 量 分 析［１７］。１９７３ 年 又 出现了更具有专一性、灵敏度和精密度的薄层色谱 法［１８， １９］。ＴＬＣ 因 其 简 便 快 速 而 应 用 于 常 规 品 质 控 制 分析， 但分析的重现性一直束缚着它的发展。同时， 也没有能够有效分离柠檬苦素类似物糖甙的展开 剂［２０］。
ＬＣ－ ＭＳ 的 应 用 使 柠 檬 苦 素 类 似 物 的 分 析 更 具 专 一性， 它能够通过被选择化合物的保留时间、结构和 分子量数据对该化合物进行鉴定。在结构分析领域 中， 质谱技术是 ＨＰＬＣ、紫外扫描和核磁共振技术的 有效补充。
Ｌｉｕ Ｌｉａｎｇ１， Ｑｉ Ｘｉａｎｇｙａｎｇ２， Ｄｏｎｇ Ｘｕｙａｎ３ （ １． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００２３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｉｌ Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ， Ｈｕｂｅｉ ４３００６２， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ ａｒｅ ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ， ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｃ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ， ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｓｔｕｄｉｅｄ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ｆｏｒｅｉｇｎ， ｂｕｔ ｈａｒｄｌｙ ｉｎ ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ． Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ ａｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ； ａｎａｌｙｓｉｓ； ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ
取分离、分析鉴定、生物合成及分布、生物活性等方面均有深入研究， 而我国对该类物质的研究报道相对较少。主
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要对柠檬苦素类似物的结构、分析方法和生物活性等方面进行探讨。
关键词： 柠檬苦素类似物； 分析方法； 生物活性
中图分类号： ＴＳ２０１．２
文献标志码： Ａ
Ｎｅｗ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｉｔｒｕｓ
柠 檬 苦 素 类 似 物 （ Ｌｉｍｏｎｏｉｄｓ） 是 一 类 高 度 氧 化 的四环三萜类植物次生代谢物质， 主要存在于芸香科 （ Ｒｕｔａｃｅａｅ） 和 楝 科 （ Ｍｅｌｉａｃｅａｅ） 植 物 的 组 织 中 。 柠 檬苦素类似物以甙元和糖甙两种形式存在， 其中甙元 是引起后苦味的主要原因［１］。１８４１ 年， 首次发现柠檬 苦 素 是 柑 橘 中 的 主 要 苦 味 成 分［２］。１９４８ 年 和 １９５１ 年 分离出诺米林和奥巴叩酮［３， ４］， 在近 ５０ 多年里又发现 了 大 部 分 甙 元 。 ２０ 世 纪 ６０ 年 代 ， Ａｒｉｇｏｎｉ 等 人 和 Ｂａｒｔｏｎ 等人用化学和 Ｘ－ ｒａｙ 的方法对柠檬苦素的结构 进 行 了 研 究 ， 阐 明 了 柠 檬 苦 素 的 分 子 式 为 Ｃ２６Ｈ３０Ｏ８， 分子量为 ４７０ ［５， ６］。１９８９ 年， Ｓｈｉｎ Ｈａｓｅｇａｗａ 博士首次 发现柠檬苦素类似物甙［７］， 至今已从柑橘属植物中分 离出 ３８ 种柠檬苦素类似物甙元及 ２０ 种柠檬苦素类似 物糖甙［８］。自 １９８９ 年发现柠檬苦素类似物具有激活谷 胱 甘 肽 Ｓ－ 转 移 酶 活 性 的 功 能 以 来［９］， 人 们 对 柠 檬 苦 素类似物的生物活性进行了大量研究。
２００７ 年第 ７ 期
第 ７ 期（总第 １０６ 期）
农产品加工·学刊
Ｎｏ．７
２００７ 年 ７ 月
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ ｏｆ Ｆａｒｍ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
Ｊｕｌ．
文章编号： １６７１－ ９６４６ （ ２００７ ） ０７－ ００３７－ ０５
柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展
ＨＰＬＣ 方法因其良好的精密度、重现性和普遍性 成为最常用的分析方法。柠檬苦素类似物的定量分析 主要采用反相高效液相色谱， 通过对流动相的筛选， 能够获得更高的分离度， 而且与正相高效液相色谱相 比， 消耗的有机溶剂也少。
Ｙｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｏｚａｋｉ 等人［３３］用 Ｃ１８ 柱， 乙腈为流动相， 采用梯度洗脱的方法， 同时分析 ６ 种糖甙； 用乙腈、 甲醇和水的混合流动相， 同时分析 ５ 种甙元。由于柠 檬苦素类似物与黄酮类物质具有相似的性质， 样品中 常伴有黄酮存在。Ｓａｉｐｅｔｃｈ［８］以 Ｃ１８ 柱为分析柱， 采 用 乙腈与 ３ ｍＭ 磷酸的水溶液为流动相， 首次同时分析 出 ６ 种糖甙、４ 种甙元和几种黄酮类物质。
２ 柠檬苦素类似物的分析方法
经多年研究， 关于柠檬苦素类似物的分析方法仍 存在许多技术问题。如缺少对柠檬苦素类似物的快速
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刘亮， 等： 柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展
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定量检测方法及商业标准； 该类类似物成分复杂， 难 以分离等。所以建立一种能够有效分析该类物质的方 法一直是科学工作者为之奋斗的目标。
１ 柠檬苦素类似物的结构及其特性
柠檬苦素类似物甙元的结构为 Ｄ－ 环的 Ｃ－ １７ 位 上连有一个呋喃环， Ｃ－ ３， Ｃ－ ４， Ｃ－ ７， Ｃ－ １６ 和 Ｃ－ １７
上连有含氧的官能团， 除脱氧柠檬苦素外， １４ 和 １５ 位上均有环氧结构。迄今为止发现的柠檬苦素类似物 甙的结构均是甙元在 Ｃ－ １７ 位和一分子葡萄糖以糖苷 键的形式结合。甙元与糖甙结构的差别决定性质的差 别， 甙元的水溶性差且具有明显苦味， 而糖甙具有良 好的水溶性且几乎没有苦味。
研究表明， 几种柠檬苦素类似物的结构见图 １， 加工处理过程会使柠檬苦素类似物的结构发生变化， 甚至造成活性丧失。影响柠檬苦素活性和稳定性的因 素主要有温度、ｐＨ 值， 以及与光和空气接触的时间 等 。 ｐＨ 值 为 ５￣７ 时 ， 柠 檬 苦 素 相 对 较 稳 定 ； 当 ｐＨ 值 大 于 １０ 时 ， 两 个 内 酯 环 开 环 ， 完 全 分 解 成 ｌｉｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ， 见 图 １ （ ｂ） 所 示 ， 加 酸 酸 化 后 ， Ｄ 环 上的羰基又迅速闭合或者形成酯， Ａ 环上羰基甲酯化 形成甲基柠檬苦素 Ｄ－ 环内酯。碱性条件下脱氧柠檬 苦素的 Ｄ 环开环形成 ｄｅｏｘｙｌｉｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ， 见图 １ （ ｃ） 。 在强酸性条件下柠檬苦素的呋喃环发生变化， 生成 ｌｉｍｏｎｅｘｉｃ ａｃｉｄ， 见图 １ （ ｄ） 所示。在温度 ４５￣８０ ℃， 柠檬苦素的降解速率依次升高， 温度 ８０ ℃时每天的 降 解 速 率 是 温 度 ４５ ℃时 的 １．４ 倍［１０］。 柠 檬 苦 素 类 似
近年来， 柠檬苦素类似物的定量分析方法主要有 薄 层 色 谱 法 、 ＴＬＣ ［２１］、 分 光 光 度 法 （ ＵＶ） 、 ［２２， ２３］ ＨＰＬＣ－ ＵＶ 、 ［２４￣２７］ 放 射 免 疫 测 定 法 （ ＲＩＡ） ［２８］、 ＨＰＬＣ－ ＭＳ ［２９］法 、 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 方 法［３０， ３１］和 快 速 色谱法 （ Ｆｌａｓｈ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ） ［３７］。 除 放 射 免 疫 测 定 法外， 大部分方法都要求对样品进行有机溶剂提取、 分离和固相萃取等前处理［３２］。
Ｒｏｕｓｅｆｆ 和 Ｆｉｓｈｅｒ［３４］建 立 了 正 相 高 效 液 相 色 谱 法 ， 采用 ＣＮ 基键合硅胶柱和正己烷、异丙醇、甲醇的三 元体系， 有效分离奥巴叩酮、诺米林、柠檬苦素和脱 氧诺米林等 ４ 种甙元。Ｈａｓｅｇａｗａ 和 Ｍａｎｎｅｒｓ［２７］使 用 微 球硅胶柱和环己烷、四氢呋喃的二元体系分离柠檬苦 素类似物甙元， 该方法的高选择性已经达到商业标 准。
分光光度法常以柠檬苦素为标准， 对柠檬苦素类 似物 总 量 进 行 定 量 。 该 方 法 以 Ｅｈｒｉｈｉｃｈ′ｓ 为 显 色 剂 ， 显色 ４０ ｍｉｎ 后， 在 ５００ ｎｍ 处比色。田庆国［２２］用该方 法 得 到 的 线 性 范 围 为 ０．７６￣２５０ μｇ／ｍＬ， 检 测 限 为 ０．７６×１０－６。Ｓｏｌｅｉｍａｎ Ａｂｂａｓｉ［２３］等人使用该法得到柠檬 苦素检测的线性范围为 ０￣５０ μｇ／ｍＬ。但该方法缺乏 专一性和普遍性， 不能被广泛应用。
柠檬苦素类似物的活性与其结构有着密切的关 系。研究表明， 柠檬苦素类似物主体结构是抗肿瘤活 性 的 关 键 。 当 柠 檬 苦 素 的 Ａ， Ｂ， Ａ′ 环 经 修 饰 后 ， 其抗癌活性降低， 而对 Ｄ 环进行修饰后， 活性几乎 没 有 变 化［１２］。 柠 檬 苦 素 类 似 物 的 抗 氧 化 能 力 远 低 于 黄