柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展_刘亮
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刘 亮 1, 戚向阳2, 董绪燕 3
( 1. 武汉工业学院 食品科技学院, 湖北 武汉 430023; 2. 华中农业大学 食品科技学院, 湖北 武汉 430070; 3. 中国农业科学院 油料作物研究所, 湖北 武汉 430062)
摘要: 柠檬苦素类似物是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢物质。国外对柠檬苦素类似物的结构、性质、提
酮类物质的原因, 可能是由于柠檬苦素类似物缺少色 原 环 的 缘 故[13]。Mendel 等 人 ( 1993 年) 对 柠 檬 苦 素 类似物的结构进行研究时发现, 呋喃环和环氧结构是 草 地 黏 虫 的 幼 虫 拒 食 的 主 要 原 因 [14]。 Murray 等 人 ( 1999 年) 报道, 柠檬苦素类似物糖甙没有昆虫拒食 作 用[15]。 在 研 究 柠 檬 苦 素 类 似 物 对 豚 鼠 口 腔 癌 的 抑 制 作用时, Miller 等人发现添加葡萄糖和 D 环开环的柠 檬苦素或诺米林对癌症的化学抑制作用没有明显的改 善[16]。
( f) Obacunone glucoside
( g) Nomilinic glucoside
图 1 图 1 几种柠檬苦素类似物的结构
物糖甙在强酸和强碱条件下均发生水解, 生成相应的 甙元和葡萄糖。在 0.5 M 的盐酸中, 温度 70 ℃下加 热 5 h, 柠檬苦素就会水解成柠檬苦素类似物甙元和 葡 萄 糖[6]。pH 值 为 8 时 , 诺 米 林 甙 ( 见 图 1 ( e) 所 示) 转化成奥巴叩酮甙 ( 见图 1 ( f) 所示) , pH 值为 3 时又转化为诺米林酸甙 ( 见图 1 ( g) 所示) [11]。因 此 在 加 工 处 理 过 程 中 要 严 格 控 制 pH 值 和 温 度 等 因 素, 防止柠檬苦素结构的变化。
收稿日期: 2007- 06- 01 作者简介: 刘亮 ( 1979- ) , 男, 山东人, 硕士, 研究方向: 天然产物化学。E- mail: rll1979@yahoo.com.cn。
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农产品加工·学刊
2007 年第 7 期
( a) Limonin
( b) Limonoic acid
( c) Deoxylimonic acid
1965 年 , Dreyer 首 次 使 用 薄 层 色 谱 ( TLC) 对 柠 檬 苦 素 类 似 物 甙 元 进 行 了 定 量 分 析[17]。1973 年 又 出现了更具有专一性、灵敏度和精密度的薄层色谱 法[18, 19]。TLC 因 其 简 便 快 速 而 应 用 于 常 规 品 质 控 制 分析, 但分析的重现性一直束缚着它的发展。同时, 也没有能够有效分离柠檬苦素类似物糖甙的展开 剂[20]。
LC- MS 的 应 用 使 柠 檬 苦 素 类 似 物 的 分 析 更 具 专 一性, 它能够通过被选择化合物的保留时间、结构和 分子量数据对该化合物进行鉴定。在结构分析领域 中, 质谱技术是 HPLC、紫外扫描和核磁共振技术的 有效补充。
Liu Liang1, Qi Xiangyang2, Dong Xuyan3 ( 1. College of Food Science and Technology, Wuhan Polytechnic University, Wuhan, Hubei 430023, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China; 3. Institute of Oil Crops Research Chinese Academy of Agriculture Sciences, Wuhan, Hubei 430062, China) Abstract: Limonoids are a group of highly oxygenated, tetracyclic triterpene secondary metabolites derivatives. The structure, characteristics, extraction and separation, analysis and identification, biosynthesis and distribution, biological activities and so on, have been studied comprehensively in foreign, but hardly in our country. The structure, analytical methodology and biological activities of limonoids are discussed in this paper. Key words: limonoids; analysis; biological activity
取分离、分析鉴定、生物合成及分布、生物活性等方面均有深入研究, 而我国对该类物质的研究报道相对较少。主
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要对柠檬苦素类似物的结构、分析方法和生物活性等方面进行探讨。
关键词: 柠檬苦素类似物; 分析方法; 生物活性
中图分类号: TS201.2
文献标志码: A
New Advances in Study of Limonoids in Citrus
柠 檬 苦 素 类 似 物 ( Limonoids) 是 一 类 高 度 氧 化 的四环三萜类植物次生代谢物质, 主要存在于芸香科 ( Rutaceae) 和 楝 科 ( Meliaceae) 植 物 的 组 织 中 。 柠 檬苦素类似物以甙元和糖甙两种形式存在, 其中甙元 是引起后苦味的主要原因[1]。1841 年, 首次发现柠檬 苦 素 是 柑 橘 中 的 主 要 苦 味 成 分[2]。1948 年 和 1951 年 分离出诺米林和奥巴叩酮[3, 4], 在近 50 多年里又发现 了 大 部 分 甙 元 。 20 世 纪 60 年 代 , Arigoni 等 人 和 Barton 等人用化学和 X- ray 的方法对柠檬苦素的结构 进 行 了 研 究 , 阐 明 了 柠 檬 苦 素 的 分 子 式 为 C26H30O8, 分子量为 470 [5, 6]。1989 年, Shin Hasegawa 博士首次 发现柠檬苦素类似物甙[7], 至今已从柑橘属植物中分 离出 38 种柠檬苦素类似物甙元及 20 种柠檬苦素类似 物糖甙[8]。自 1989 年发现柠檬苦素类似物具有激活谷 胱 甘 肽 S- 转 移 酶 活 性 的 功 能 以 来[9], 人 们 对 柠 檬 苦 素类似物的生物活性进行了大量研究。
2007 年第 7 期
第 7 期(总第 106 期)
农产品加工·学刊
No.7
2007 年 7 月
Academic Periodical of Farm Products Processing
Jul.
文章编号: 1671- 9646 ( 2007 ) 07- 0037- 05
柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展
HPLC 方法因其良好的精密度、重现性和普遍性 成为最常用的分析方法。柠檬苦素类似物的定量分析 主要采用反相高效液相色谱, 通过对流动相的筛选, 能够获得更高的分离度, 而且与正相高效液相色谱相 比, 消耗的有机溶剂也少。
Yoshihiko Ozaki 等人[33]用 C18 柱, 乙腈为流动相, 采用梯度洗脱的方法, 同时分析 6 种糖甙; 用乙腈、 甲醇和水的混合流动相, 同时分析 5 种甙元。由于柠 檬苦素类似物与黄酮类物质具有相似的性质, 样品中 常伴有黄酮存在。Saipetch[8]以 C18 柱为分析柱, 采 用 乙腈与 3 mM 磷酸的水溶液为流动相, 首次同时分析 出 6 种糖甙、4 种甙元和几种黄酮类物质。
2 柠檬苦素类似物的分析方法
经多年研究, 关于柠檬苦素类似物的分析方法仍 存在许多技术问题。如缺少对柠檬苦素类似物的快速
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刘亮, 等: 柑橘中柠檬苦素类似物的研究新进展
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定量检测方法及商业标准; 该类类似物成分复杂, 难 以分离等。所以建立一种能够有效分析该类物质的方 法一直是科学工作者为之奋斗的目标。
1 柠檬苦素类似物的结构及其特性
柠檬苦素类似物甙元的结构为 D- 环的 C- 17 位 上连有一个呋喃环, C- 3, C- 4, C- 7, C- 16 和 C- 17
上连有含氧的官能团, 除脱氧柠檬苦素外, 14 和 15 位上均有环氧结构。迄今为止发现的柠檬苦素类似物 甙的结构均是甙元在 C- 17 位和一分子葡萄糖以糖苷 键的形式结合。甙元与糖甙结构的差别决定性质的差 别, 甙元的水溶性差且具有明显苦味, 而糖甙具有良 好的水溶性且几乎没有苦味。
研究表明, 几种柠檬苦素类似物的结构见图 1, 加工处理过程会使柠檬苦素类似物的结构发生变化, 甚至造成活性丧失。影响柠檬苦素活性和稳定性的因 素主要有温度、pH 值, 以及与光和空气接触的时间 等 。 pH 值 为 5 ̄7 时 , 柠 檬 苦 素 相 对 较 稳 定 ; 当 pH 值 大 于 10 时 , 两 个 内 酯 环 开 环 , 完 全 分 解 成 limonic acid, 见 图 1 ( b) 所 示 , 加 酸 酸 化 后 , D 环 上的羰基又迅速闭合或者形成酯, A 环上羰基甲酯化 形成甲基柠檬苦素 D- 环内酯。碱性条件下脱氧柠檬 苦素的 D 环开环形成 deoxylimonic acid, 见图 1 ( c) 。 在强酸性条件下柠檬苦素的呋喃环发生变化, 生成 limonexic acid, 见图 1 ( d) 所示。在温度 45 ̄80 ℃, 柠檬苦素的降解速率依次升高, 温度 80 ℃时每天的 降 解 速 率 是 温 度 45 ℃时 的 1.4 倍[10]。 柠 檬 苦 素 类 似
近年来, 柠檬苦素类似物的定量分析方法主要有 薄 层 色 谱 法 、 TLC [21]、 分 光 光 度 法 ( UV) 、 [22, 23] HPLC- UV 、 [24 ̄27] 放 射 免 疫 测 定 法 ( RIA) [28]、 HPLC- MS [29]法 、 毛 细 管 胶 束 电 色 谱 方 法[30, 31]和 快 速 色谱法 ( Flash chromatography) [37]。 除 放 射 免 疫 测 定 法外, 大部分方法都要求对样品进行有机溶剂提取、 分离和固相萃取等前处理[32]。
Rouseff 和 Fisher[34]建 立 了 正 相 高 效 液 相 色 谱 法 , 采用 CN 基键合硅胶柱和正己烷、异丙醇、甲醇的三 元体系, 有效分离奥巴叩酮、诺米林、柠檬苦素和脱 氧诺米林等 4 种甙元。Hasegawa 和 Manners[27]使 用 微 球硅胶柱和环己烷、四氢呋喃的二元体系分离柠檬苦 素类似物甙元, 该方法的高选择性已经达到商业标 准。
分光光度法常以柠檬苦素为标准, 对柠檬苦素类 似物 总 量 进 行 定 量 。 该 方 法 以 Ehrihich′s 为 显 色 剂 , 显色 40 min 后, 在 500 nm 处比色。田庆国[22]用该方 法 得 到 的 线 性 范 围 为 0.76 ̄250 μg/mL, 检 测 限 为 0.76×10-6。Soleiman Abbasi[23]等人使用该法得到柠檬 苦素检测的线性范围为 0 ̄50 μg/mL。但该方法缺乏 专一性和普遍性, 不能被广泛应用。
柠檬苦素类似物的活性与其结构有着密切的关 系。研究表明, 柠檬苦素类似物主体结构是抗肿瘤活 性 的 关 键 。 当 柠 檬 苦 素 的 A, B, A′ 环 经 修 饰 后 , 其抗癌活性降低, 而对 D 环进行修饰后, 活性几乎 没 有 变 化[12]。 柠 檬 苦 素 类 似 物 的 抗 氧 化 能 力 远 低 于 黄