清道夫受体A基因的表达和调控研究进展(一)

清道夫受体A基因的表达和调控研究进展(一)
摘要A类清道夫受体（SR-A）的表达具有巨噬细胞特异性，这与SR-A启动子上的PU.1/Spi-1识别位点有关。

SR-1具有广泛的配体的结合活性，在机体的防御、细胞粘附及信息转导等过程中起重要作用，对修饰脂蛋白的介导、内吞可能是动脉粥样硬化斑块形成的重要原因。

关键词清道夫受体A；基因表达调控
清道夫受体A（scavengerreceptorA,SR-A）是一类主要存在于巨噬细胞表面的膜糖蛋白，又称为巨噬细胞清道夫受体（macrophagescavengerreceptor,MSR）。

大量研究表明，SR-A具有广泛的配体结合活性，能结合和内吞多种多聚大分子化合物如修饰脂蛋白、马来酰牛血清白蛋白（maleylatedbovineserumalbumin,M-BSA）、多聚次黄苷酸、丝氨酸磷脂及一些多糖和细菌脂多糖等，参与机体的防御、细胞粘附及信息转导等多种生理过程1]。

SR对修饰性脂蛋白如乙酰化LDL（AcetylatelDL,AcLDL）、氧化LDL（oxidativeLDL,oxLDL）的介导、内吞和降解，由于缺乏LDL受体样精确的下调功能，致使细胞能不断地摄取修饰脂蛋白，大量胆固醇在细胞内积聚形成泡沫细胞，在动脉粥样硬化斑块（AS）的发生发展中起着相当重要的作用，因此对SR-A基因表达调控及其功能的深入研究将有可能为AS研究提供新的思路。

1SR-A基因结构
SR-A包括Ⅰ型和Ⅱ型（SR-AⅠ和SR-AⅡ），是最早被分离纯化和克隆的清道夫受体，人SR-A 基因定位于8号染色体上，长大约80kb，由11个外显子和10个内含子组成2]。

Ⅰ、Ⅱ型SR-AcDNA是由同一基因编码，按不同的剪切方式产生的。

人SR-RⅠ和SR-AⅡcDNA分别含1353bp、1074bp开放阅读框，各自编码451和358个氨基酸的蛋白质。

外显子1编码5’端非翻译区，外显子2编码细胞质区，外显子3编码转膜区，外显子4和5编码α-螺旋卷曲螺旋区，6～8外显子编码胶原区。

第9外显子编码Ⅱ型、第10、11外显子编码Ⅰ型清道夫受体的C-末端。

目前已克隆出的4种哺乳动物（小鼠、牛、兔、人）SR-A各区序列具有高度保守性，SR-AⅠ的氨基酸序列同源性达64%～81%，SR-AⅡ氨基酸序列同源性达60%～84%，这些保守序列与结构和功能的关系尚不清楚。

α-螺旋区与功能性三聚体形成有关；序列分析及类比、突变等研究都强烈提示SR-A的正电荷胶原区是多聚阴离子配体的结合位点，缺少胶原区的SR-A则能防止配体的结合。

将牛SR-A的胶原区内赖氨酸突变为丙氨酸，发现单独337位赖氨酸或327-334和340位赖氨酸的突变能减少AcLDL和oxLDL的结合和内吞1]，说明SR-A的胶原蛋白域不仅是结合配体所需要的，而且也是其配体大多数为多聚阴离子化合物的主要原因。

Ⅵ区又称为SRCR区（scavengerreceptorcysteinrich,SRCR），其作用仍不甚清楚，但许多含SRCR区的哺乳动物蛋白间接或直接与机体防御功能。

1.Ⅱ型的主要区别在于Ⅱ型缺乏富含半胱氨酸的Ⅵ区，而被6～17个C-末端氨基酸残基所取代。

尽管C-端截短了，但Ⅱ型仍有高度的亲和性和广泛的配体结合活性，与Ⅰ型无明显差异。

因此认为SRCR区（即Ⅵ区）对SR的结合活性和特异性并不是必须的。

两型SR-A结构上的差异是否会有功能的不同，目前仍不清楚。

2SR-A基因的表达及分布
SR-A主要存在于不同组织和器官的巨噬细胞上，尤其是枯否氏细胞和脾淋巴结的巨噬细胞上2]，在肝窦内皮细胞、成纤维细胞和某些平滑肌细胞亦有表达4]，而在血管内皮细胞不表达5，6]。

免疫电镜结果显示，SR-A主要分布于巨噬细胞表面、囊泡和核小体上。

两型SR-A 可在不同组织器官的巨噬细胞上共表达，但表达量不同。

SR-A在单核巨噬细胞的表达调控有赖于巨噬细胞分化阶段，是巨噬细胞分化成熟的标志之一7]。

Geng等人8]用RT-PCR和免疫印迹及荧光激活细胞分选仪（fluorescence-activatedcellsorter,FACS）研究了两型SR-A在不同类型细胞表达特点，发现在单核细胞两型SR-AmRNA、蛋白质均低，但在单核细胞向巨噬细胞的分化过程中，伴随Ⅰ型SR快速选择性升高，这种高水平表达维持到单核源性巨噬细胞变成充满胆固醇脂质的泡沫
细胞为止，Ⅱ型SR-AmRNA无明显改变。

提示Ⅰ型SR-A在单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞赂泡沫细胞的转化过程中均起着相当重要的作用。

血管内皮细胞有清道夫受体活性，但研究表明原代培养的兔静脉和牛主动脉内皮细胞上无SR-AⅠ、SR-AⅡ受体mRNA表达，用PMA诱导亦不能增加SR-A的表达和AcLDL的摄入，提示血管内皮细胞表面缺乏SR-A活性，其对修饰脂蛋白的摄入可能通过其它类型SR途径实现的6]。

某些SMC株可能存在不同水平的SR受体活性，用PMA处理的SMC对AcLDL的降解增加大约5倍，荧光分选法发现从喂高脂高胆固醇饲料的兔主动脉分离的SMC对AcLDL降解水平明显升高，提示AS斑块来源的SMC，其生物学特性就其SR活性而言是不同的，可能是某些生长因子能刺激SR表达，如果这些刺激因子是来源于巨噬细胞源性泡沫细胞，这就可以解释为何斑块中SMC源性泡沫细胞形成迟于巨噬细胞源性泡沫细胞4]。

Bickel等人5]从新西兰兔主动脉SMC克隆出的SR与鼠、人、牛SR-AⅠ或Ⅱ比较，其cDNA及氨基酸水平的同源性均在70%以上。

提示SMC上的SR-A受体活性可能是SMC源性泡沫细胞形成的主要原因。

3清道夫受体基因调控元件与表达调控
在细胞培养体系中，发现许多因素可影响SR的活性或基因表达，如佛波酯、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、血小板分泌产物等能促进SR-A表达、内毒素、肿瘤坏死因子、γ-干扰素等可使SR-A表达下调。

但不同的因子SR-A表达调控机制不同，这可能与作用于SR-A基因不同调节元件有关。

Moulton9]等人将人和牛SR-A启动子序列-696～+46和-814～+46分别转到不同的细胞内，检测其对荧光素酶活性的影响，结果表明，在THP-1、P388D1和U937等巨噬细胞样细胞中，荧光素酶活性明显增加，而在HeLa细胞等非巨噬细胞样细胞中，荧光素酶活性较低。

提示SR-A翻译起始区上游序列具有巨噬细胞特异性。

通过基因转染、DNaseⅠ足迹分析、直接点突变等方法已明确了SR-A基因启动子有3个功能性顺式作用调节区，即启动子区、增强子区、抑制子区10]。

SR-A启动子位于主要转录起始位点上游的-245～+46之间，包含两个转录因子结合区9]。

一是PU.1/Spi-1转录因子结合区。

PU.1/Spi-1是一种ets区转录因子，PU.1中心识别基序（corerecognitionmotif）存在于大多数巨噬细胞及B细胞特异性表达的基因启动子上，如免疫球蛋白κ和λ基因及免疫球蛋白J链基因、CD11a、CD11c、巨噬细胞炎症蛋白-α等，PU.1/Spi-1能有效地介导SR-A的细胞特异性表达。

提示SR-A启动子上PU.1/Spi-1识别位点与SR-A基因的巨噬细胞特异性表达有关。

二是一个ets区蛋白复合物结合位点，可与AP-1基因家族蛋白（如c-Jun、JunB蛋白等）有高度亲和性，能形成三重复合物，这些蛋白质能共同促进SR-A 的表达7]。

序列分析表明SR-A基因启动子区缺乏通常的TATA盒，只是在SR-AcDNA的5’端翻译起始区上游-18～-37bp间有两个TATA样序列；没有LDL受体启动子的CCAAT盒；在SR-A的启动子区也没有发现类似LDL受体基因受固醇调节的固醇类反应元件序列，这一结果与清道夫受体活性一致，不受胆固醇调节，使脂质易于在细胞内集聚形成泡沫细胞2]。

SR-A增强子区位于-4.1～-4.8kb〔9，10〕，是PMA诱导SR-A表达必需的区域。

PMA对SR的转录激活作用是由AP-1和ets区转录因子分别结合到启动子和增强子区所介导的7]。

SR-A抑制子区位于-4.8～-6.5kb处，可抑制70%～80%的SR-A启动子活性，能抑制未分化THP-1细胞向巨噬细胞的分化。

抑制区的缺失，可使TPA诱导的SR-A表达水平明显增加，与疱疹病毒的胸苷酸激酶启动子共同组成的片段能抑制TPA诱导的加强反应。

在-592～－570和-424～－402之间各有一个23bp的颠倒重复序列，这个重复序列中含有一段GGGATTA-CA序列，与介导白介素-2基因在T淋巴细胞特异表达的T细胞元件GGGPuTTT(C/A)A高度同源2]。

这3个顺式作用元件中都含有AP-1基因家族成员蛋白的保守结合序列（TGA（G/C）TCA），
同时，在增强子及抑制子区还含有ets区转录因子的结合序列。

c-Jun、est2和组成型ras的共同表达，可协同增加含SR-A基因3个调节元件的片段的转录效率，提示SR-A的转录是ras、AP-1和ets区蛋白有关的信号转导通路密切相关的11]。

Horvai等人10]的研究表达，291bp 的SR-A启动子近端区域加上400bp的位于基因上游的增强子元件，在转基因小鼠中能驱动人生长激素受体基因在巨噬细胞的特异表达，在其它组织器官如脾、肠组织只有少量表达，甚至不表达，PU.1结合位点的突变则严重影响转基因的表达，这一转基因动物实验进一步证明SR-A启动子和增强子具有巨噬细胞特异性，PU.1结合位点是维持SR-A启动子活性及组织细胞特异性所必需的。

因此，利用该基因的启动子和增强子可能建立巨噬细胞特异性转基因动物，这对研究某个特定基因对巨噬细胞功能的影响具有重要的应用价值。

由于巨噬细胞SR-A基因是一类单核细胞向巨噬细胞分化过程中上调的有代表性的基因，能在巨噬细胞特异性表达。

因此，转SR-A基因的细胞或动物也许能作为巨噬细胞分机机制研究有用的模型。

4清道夫受体的功能
4.1清道夫受体与动脉粥样硬化的关系
SR-A具有广泛的配体活性，与修饰脂蛋白AcLDL和oxLDL的高亲和性结合，可能是泡沫形成的主要原因。

转染SR-A受体基因后的CHO细胞胞浆内脂质集聚，能形成泡沫样细胞；SR-A 缺乏的小鼠腹腔巨噬细胞对AcLDL摄取减少80%，而对oxLDL的摄取只减少30%，提示SR-A 是AcLDL的主要代谢途径，而oxLDL只有一小部分是SR-A摄入的，大部分可能其它受体途径12，13]。

SR-A和LDL受体同时缺陷的小鼠与只有LDL受体缺乏的小鼠相比，主动脉AS 斑块面积减少40%14]。

这些结果提示SR-A在动物AS斑块形成中起着重要的作用。

免疫组化结果在显示不同阶段的人主动脉或冠脉粥样硬化斑块中均能检测到抗清道夫受体抗体的阳性细胞。

在脂纹性病变中，染色反应为强阳性，而在斑块坏死区及纤维斑块中呈弱阳性，这些阳性细胞以巨噬细胞为主，其次为SMC15]。

提示，SR-A活性与人AS的病变程度密切相关，在早期SR-A受体分布较多，受体作用较强，而在斑块粥样坏死区、纤维斑块及钙化区（晚期病变）泡沫细胞减少或消失，SR-A受体作用减弱。

Wolle等16]用鼠转铁蛋白启动子驱动牛SR-A型表达建立了转基因鼠，由于转铁蛋白启动子的肝组织特异性，使该转基因主要在肝内表达，仅微量出现在肾和脑内。

实验结果表明SR-A 基因在肝内的表达有助于消除血内的ApoB，使过剩的血浆胆固醇通过胆汁酸排出体外，具有抗AS的作用，可见SR-A在不同组织细胞的表达对AS的作用不同。