多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法

多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法

1 范围

本非标方法规定了番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶紫外测定方法。

本非标方法适用于番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶活性的测定。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用紫外分光光度法在408nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力，反应式如下：

多酚氧化酶

邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2→邻醌＋ H2O

4 试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为 GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。

4.1 磷酸盐缓冲液[PH7.0]：0.2mol/LNaH2PO4：0.2mol/LNa2HPO4=39：61；

0.2mol/L的NaH2PO4：准确称取NaH2PO4·2H2O 3.12g加重蒸水至100ml溶解；

0.2mol/L的 Na2HPO4：准确称取Na2HPO4·12H2O 7.16g加重蒸水至100ml溶解。

4.2 邻苯二酚溶液[c=0.04mol/L]:准确称取0.44g邻苯二酚加重蒸水至100ml溶解。

5 仪器

5.1 紫外分光光度计。

5.2 高速冷冻离心机，50ml离心管。

5.3 分析天平：感量0.0001g。

5.4 超声波清洗仪（可调温）。

6 试样的制备和保存

6.1 试样的制备：ppo粗酶提取液

番茄酱：取适量样品搅拌均匀，称取2g样品放入离心管里，加入10mL（固液比为20%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。

土豆：新鲜土豆先用自来水、再用蒸馏水洗净，擦干，削去1cm厚果皮后，切块，放入打浆机中打成匀浆状，称取5g样品放入离心管中，加入8.23mL（固液比为60.6%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。

香蕉：去皮放入自封袋内，用手挤压成匀浆状，称取5g样品放入离心管中，加入8.23mL（固液比为60.6%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。

将固液混合样品在40℃超声处理270s后，在-4-0℃8500转下离心15分钟，萃取上清液为ppo粗酶提取液。

6.2 试样的保存

将试样于4℃冷藏箱保存。

7 测定步骤

7.1 酶反应吸收曲线扫描

反应体系为0.5mL粗酶液+0.5mL0.04mol/L的邻苯二酚+1.0mL磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混匀反应稳定后，使用紫外分光光度计在300-600nm下进行波长扫描，在波长408nm处得到最大吸光值。

7.2 PPO活性的测定

反应体系为0.5mL粗酶液+0.5mL0.04mol/L的邻苯二酚+1.0mL磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混匀反应1min 后，迅速倒入1 cm 比色皿中，放入紫外分光光度计中在波长408nm下进行测定。记录408 nm 下的吸光度变化(每5 s 记录一次吸光值, 共记录3 min) , 重复测 2 次。

8 结果计算

以每分钟内A408nm处吸光值变化0.001为1个酶活力单位，按下列公式(1)计算多酚氧化酶的比活性:

X=△A

0.001×W×T ×酶提取液总量(mL)

测定时酶液用量(mL)

(1)

△A—为反应时间内吸光度的变化值；

X ―酶的比活性，单位为0.001A·g－1·min－1；

T ―反应时间，单位为min；

W―为样品鲜重，单位为g。

9 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。