管碟法

实验2 管碟法测定土霉素生物效价

一、目的要求

1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。

2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。

二、基本原理

衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种。本实验采用管碟法测定抗生素的效价。

管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。

三、实验材料

1、培养基（供摊布平板用）

蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g

蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟

2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）

3、土霉素碱标准品

4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等

管碟法测定抗生素效价

一、目的和要求

1、了解管碟法的原理。

2、掌握二剂量法测定抗生素效价单位的技术和计算方法。

二、原理

抗生素的生物检定是以抗生素对微生物的抗菌效力作为效价的衡量标准，具有与应用原理相一致、用量少和灵敏度高等优点。管碟法是琼脂扩散法中的一种，已被各国药典广泛采用，作为法定的抗生素生物检定方法。

当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系。

三、实验材料

1、四环素类抗生素的标准品和样品。

2、试验菌：藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）。

3、培养基：250ml三角瓶分装150ml LB琼脂，150ml三角瓶分装50ml LB琼脂，50ml三角瓶分装20ml藤黄八叠球菌悬液用培养液。

4、灭菌物品：培养皿，牛津杯（内径：6.0±0.1mm，外径：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸缓冲液，弯头镊子，15×150mm试管，瓦盖。

5、其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平仪，游标卡尺。

四、实验实施

1、配制标准品溶液

2、配制样品溶液

3、制备菌悬液。

4、制备平板：

（1）取6套无菌培养皿，分别加入约20mlLB培养基后，置水平玻璃板上凝固，作为底层。（2）另取冷却至50℃左右的50ml LB培养基，加入1ml试验菌悬液，迅速摇匀后，用10ml破口吸管取6ml混菌培养基倒在底层平板上，作为菌层，并放置在水平玻璃板上凝固。

5、在培养基平板底部作好相应标记，用弯头镊子在每个培养皿中等距离放入4个牛津杯。

6、用滴管分别将高、低浓度的标准品和样品溶液加入到牛津杯中，以滴满为度，换上皿盖。

7、将培养皿平稳送入恒温箱，37℃下培养16～18h。

8、用游标卡尺测量抑菌圈直径

5. 多粘菌素E 效价测定

本实验用不同浓度的多粘菌素E 溶液作标准曲线，以抑菌圈直径的平方值为横坐标，多粘菌素E标准品效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。具体作法如下：

(1) 大肠杆菌菌悬液制备取活化的大肠杆菌A1.543 菌种接种于大肠杆菌活化培养基斜面，37℃培养24 h，然后每支斜面加无菌生理盐水10 mL，刮下菌苔，搓匀。

(2) 倒底层平板将灭菌的2%琼脂水底层培养基加热融化后，冷凉至45~50℃左右，倾倒入培养皿制成底层

平板，每人2～3 个，凝固后于皿底贴上标签。

(3) 制备混菌上层平板将检测用上层培养基加热融化后，冷凉至50℃左右，50 mL 上层培养基加入大肠杆菌菌悬液0.5mL，轻轻摇匀。在每一培养皿底层平板上加入10 mL 混菌上层培养基(动作迅速，以免培养甚中琼脂凝固；倾倒上层培养基时不要有气泡。若有气泡应赶到平板边缘)，凝固后成上层平板即为双碟备用。制备双碟时必须在水平的桌面上，并选择平底的培养皿。贴好标签的培养皿，放于白瓷盘上。

(4) 滴加多粘菌素E 标准品和样品先将10 000 u／mL 的标准多粘菌素E，用1/15mol／L pH 6.0磷酸缓冲液稀释成800、1000、1200 u／mL。根据酸化后滤液颜色粗略估计发酵样品效价，用1/15 mol/LpH 6.0 的磷酸缓冲液稀释至1000 u／mL。每人取制备好的2～3 个双碟，打开皿盖，用无菌镊子夹取已灭菌的钢管(牛津杯)，每个双碟中放置钢管6 个(如图5－1～2 所示)。其中相间隔的3 个钢管滴加多粘菌素E

标准液。另外3 个钢管滴加发酵液样品。A 管中用无菌滴管滴加多粘菌素E 800 u／mL 的标准液，B 管滴加多粘菌素E 1000 u/mL的标准液，C 管滴加多粘菌素E 1200 u／mL 的标准液，D 管滴加发酵样品稀释液。滴加时必须仔细小心，勿在小钢管中形成气泡，勿使溶液流出管外，加的量各管要一致，恰好滴满。滴加完毕后，加上灭菌陶瓷盖。将放双碟的白瓷盘小心平端于37℃恒温箱内，培养6～8 h 后取出。

(5) 抑菌圈直径的测量及校正将双碟中的钢管倒入白瓷缸中，加洗涤灵和水，然后煮沸0.5 h，清水冲洗晾干。用玻璃皿盖换下白陶瓷盖，然后用卡尺测量双碟中每管抑菌圈的直径。

管碟法；抗生素；效价；抑菌圈

摘要:

目的提高管碟法测定抗生素效价的准确性。方法按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案。结果减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。结论可以提高测定结果的准确性。

Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper me asure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental an d artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results.

Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring

管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。

1. 实验器材的准备